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【摘要】目的:比较冰冻血小板和新鲜血小板输注后血液的促凝功能。方法:该课题以100名志愿患者为研究对象,抽取其新鲜血液2ml后,随机输注50份冰冻血小板和50份新鲜血小板悬液,24小时后重新采血。分别经酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测冰冻血小板和新鲜血小板输注前后的β-血小板球蛋白(β thromboglobulin,β-TG)、血小板α-颗粒膜蛋白-140(granule membrane protein 140,GMP-140)和血小板第4因子(platelet factor 4,PF4)。采用Born氏比浊法检测冰冻血小板和新鲜血小板输注前后的聚集率,所用诱导剂的终浓度为花生四烯酸(arachidonic acid,AA)782.0 µmol/L、腺苷二磷酸(adenosine diphosphate,ADP)47.6µmol/L和胶原(collagen)4.8mg/L。结果:冰冻血小板释放的β-TG、GMP-140和PF4分别为(51.5±4.4)ng/ml、(32.1±6.8)ng/ml和(25.5±4.9)ng/ml,新鲜血小板释放的β-TG、GMP-140和PF4分别为(40.3±4.0)ng/ml、(24.3±4.8)ng/ml和(18.8±3.6)ng/ml,冰冻血小板释放的β-TG、GMP-140和PF4均高于新鲜血小板(P215×1011,于当日采集后3h内输注,输注量为1个治疗量。采集出的新鲜血小板在无菌条件下注入浓度为4%～6%的二甲基亚砜,置于-8°C以下冰箱内保存即为冰冻血小板,保存期为半年。
1.2血小板输注
随机选择100名志愿输注新鲜血小板或冰冻血小板患者,输注前分别先抽取新鲜血液2ml。分别取50份冰冻血小板和50份新鲜血小板悬液,每份20单位。冰冻血小板输注前置42°C恒温箱解冻,经生理盐水洗涤。采用随机输注方法,输注24小时后再分别抽取新鲜血液2ml。
1.3β-TG、GMP-140和PF4检测
将输注前后分别抽取的新鲜血液,3000×g离心20min,取上清液,采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosor
-bent assay,ELISA)检测β-TG、GMP-140和PF4。试剂采用罗氏公司(Roche Diagnostics)的ELISA试剂盒,变异度分析控制在15%以内。
1.4血小板聚集功能
采用Born氏比浊法[5]检测输注前后血小板的聚集率,所用诱导剂的终浓度为花生四烯酸(arachidonic acid,AA)782.0µmol/L、腺苷二磷酸(adenosine diphosphate,ADP)47.6µmol/L和胶原(collagen)4.8mg/L。
1.5统计学分析
数据按公式“促凝功能变化=输注后促凝功能-输注前促凝功能”,以x±s表示,采用SPSS软件包进行完全随机化设计资料的方差分析。
2结果
2.1输注前后冰冻血小板和新鲜血小板β-TG的表达情况
图1 冰冻血小板和新鲜血小板β-TG的表达情况
*:与冰冻血小板相比,P β-TG是血小板α颗粒合成的特异性蛋白,由四条肽链组成,通过抑制血管内皮细胞生成前列环素(prostacyclin,
PGI2)而发挥促凝作用[7]。由于β-TG主要存在于血小板中,因此测定血小板释放的β-TG已成为反映血小板促凝功能的一项指标。GMP-140是血小板激活脱颗粒反应中α颗粒释放的遗留产物,在血小板被激活时被释放出来,可促进细胞之间的连接,具有介导活性血小板与内皮细胞相互作用的功能,在凝血过程中起重要作用。因而GMP-140也是反映血小板促凝活性的分子标志物之一[8]。PF4是血小板α颗粒中的另外一种活性因子,为四聚体糖蛋白,由相同的70个氨基酸单体以共价键结合,单体的相对分子质量为7800。每个单体的N末端具有可变区,单体通过此区以两个二硫键锚定在PF4蛋白质核心上,此区由3个非平行β折叠和一个α螺旋结构组成[9]。PF4在血小板粘附、聚集、活化时以蛋白多糖复合物的形式从血小板中释放,能降低内皮细胞表面硫酸乙酰肝素的抗凝作用,并使血小板聚集,促进血液在血管内皮细胞表面凝固,因此PF4也是反映血小板促凝反应的标记物[10]。我们的研究结果表明,机体输注冰冻血小板后释放β-TG、GMP-140和PF4多于输注新鲜血小板,说明输注冰冻血小板后机体的促凝功能强于输注新鲜血小板。
我们在实验中还发现,在AA、ADP和胶原分别作为诱聚剂的情况下,输注冰冻血小板后的血液聚集率均高于输注新鲜血小板后。血小板聚集是血小板的主要功能之一,在止、凝血过程中,血小板聚集起着关键的作用[11]。因此,血小板聚集功能在一定程度上反映了血小板的促凝活性。此外,Owens[12]等报道患者输注新鲜血小板后,血小板的粘附能力只有输注冰冻血小板的53%,提示冰冻血小板的粘附功能也强于新鲜血小板。冰冻血小板的粘附能力和促凝活性增强可能与冰冻后血小板对于凝血因子V的结合能力增强有关。刘景汉[13]等通过观察大量血小板输注的临床病例,发现冰冻机采血小板的止血效果优于常规保存液体血小板,尤其是冰冻血小板输注取得了满意疗效。在该试验中,我们发现输注冰冻血小板后机体的促凝功能明显优于输注新鲜血小板后。我们在临床工作中也发现,冰冻血小板输血反应的发生率低于新鲜血小板,而且取得了较为满意的效果。滕本秀等[14]则通过临床实践,证实了冰冻新鲜血小板除了具有新鲜血小板的优点外,还具有保存期长,无污染危险,使用方便,随用随取等优点,因而更有利于危重出血患者的抢救治疗。但输注冰冻血小板之后,血小板计数的增加不及输注新鲜血小板后明显[15]。
综上所述,冰冻血小板的促凝血功能强于新鲜血小板,并且有充足的时间进行病毒检测,减少了传染性疾病传播的风险。虽然冰冻血小板在提升血小板计数方面不及新鲜血小板,但是在血源日趋紧张的今天,经深低温保存的冰冻血小板在安全性和止血效果方面均尤于新鲜血小板,可以大量长期储备,以满足临床应用血小板的需求。
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