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摘要：目的：研究口服附子总生物碱后乌头碱、新乌头碱、次乌头碱在大鼠体内的药动学特征。方法：口服给予大鼠附子总生物碱后，断尾取血，采用甲醇沉淀冷冻干燥法处理血浆样品。采用HPLC-MS/MS分析方法检测乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的血药浓度。药时数据用中国药理学会3p97药代动力学程序计算主要药动学参数。结果：本实验建立的用于检测大鼠血浆的HPLC-MS/MS分析方法，其灵敏度高、专属性强、稳定性好，能很好的符合生物样品分析的要求。乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的药动学曲线经拟合均符合口服给药的二室模型。乌头碱主要药动参数：T�1/2α=3.32±1.56min，T�1/2β=886.61±242.14min，AUC=86.558±9.462mg•L-1•min-1，T�peak=6.989±1.546min，C�max=83.549±10.459ng•mL-1。新乌头碱主要药动参数：T�1/2α=15.4989±4.8712min，T�1/2β=1255.808±684.891min，AUC=297.212±74.642ng•mL-1•min，T�peak=15.782±7.541min，C�max=202.983±30.781ng•mL-1。次乌头碱主要药动参数：T�1/2α=125.482±51.654min，T�1/2β=1007.757±349.485min，AUC=241.206±9.147ng•mL-1•min，T�peak=16.765±5.478min，C�max=164.302±20.891ng•mL-1。结论：灌胃给予附子总生物碱后乌头碱、新乌头碱、次乌头碱在大鼠体内的过程符合口服二室模型。
关键词：附子；附子总生物碱；乌头碱；新乌头碱；次乌头碱；HPLC-MS/MS；毒代动力学
中图分类号：R285.5文献标识码：A
文章编号：1007-2349（2011）03-0049-04
乌头类有毒中药如川乌、草乌、附子等是中医临床常用的有毒中药。已有研究表明乌头类有毒中药具有强心［1~5］、抗休克［6］、抗心律失常［7］、抗炎镇痛［8~9］、致心律失常［10］抑制呼吸中枢、兴奋迷走中枢等作用，乌头碱类生物碱如乌头碱、新乌头碱、次乌头碱既是乌头、附子中的主要有毒成分，也是发挥部分药效的主要有效成分。近年来乌头碱类生物碱的毒理学研究越来越深入，如已有文献报道了乌头碱对结肠间质细胞、神经细胞、心肌细胞、大鼠胚胎等的影响机制［11~13］，但体内过程的研究相对较少。
由于乌头碱类生物碱毒性大，动物血浆内的含量较低，对热不稳定，容易发生水解。有研究发现乌头碱在甲醇溶液中不稳定，常温下放置短时间即可产生新的物质［14~15］。故本实验运用高灵敏的HPLC-MS/MS检测样品中乌头碱类生物碱（乌头碱、新乌头碱、次乌头碱）的含量，采用甲醇沉淀冻干法处理血浆样品，对口服给予附子总生物碱后乌头碱、次乌头碱、新乌头碱在大鼠体内的药动学特点进行研究。
1实验材料
1.1实验仪器API3000质谱仪（AB公司）；Dionex高效液相色谱仪；WH-1微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂）；TCL-16g型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；FD-1B-50型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；
1.2试剂与试药乌头碱（Aconitine，A），中国药品生物制品检定所提供，批号：110720-200410；新乌头碱（Mesaconitine，MA），中国药品生物制品检定所提供，批号：110798-200404；次乌头碱（Hypaconitine，HA），中国药品生物制品检定所提供，批号：110799-200505；附子双酯型生物碱，为本课题组化学组提供，经HPLC测定生物碱含量为：乌头碱：0.0778mg/mL，新乌头碱：0.978mg/mL，次乌头碱：0.3274mg/mL。甲醇为色谱纯，三乙胺、二氯甲烷、盐酸等为分析纯，水为双蒸水。
1.3实验动物SD大鼠，雌雄各半，成都中医药大学动物实验中心提供（实验动物生产许可证号：08-049），体重（280±20）g，健康合格，检疫后备用。
2实验方法
2.1检测条件
2.1.1高效液相色谱条件色谱柱：PhenomenexGeminiC�18，Φ250mm×Φ4.6mm，5μm；预柱：Phenomenex；ChromGuardHPLCC�18Column，Φ4mm×3mm，5μm，流动相：甲醇-水-三乙胺=80∶20∶0.1流速：0.6mL•min-1；柱温：40℃；进样量：20μL。
2.1.2质谱条件离子源：ESI，正离子MRM扫描，CUR13.0L•min-1，CAD6.0L•min-1，IS：5500V，TEM：450℃，GS1：33.0L•min-1，GA2：33.0L•min-1，DP：100.0V，FP400.0V，EP：11.0V，CE：60.0V.
MRM检测：乌头碱：646.0/586.0，646.0/105.0；次乌头碱：616.3/338.5；新乌头碱：632.0/105.0
2.2对照品溶液的配制分别精密称取乌头碱、新乌头碱、次乌头碱对照品适量，用二氯甲烷制成每1mL含0.135mg，0.104mg和0.132mg的溶液。再取一定量溶液以二氯甲烷稀释成浓度分别为1.35、1.04和1.32μg/mL的对照品溶液保存在4℃的避光冰箱中备用。
2.3样品处理方法取血浆样品200μL置于离心管中，按1∶4的比例加入甲醇800μL，涡旋振荡3min，沉淀蛋白，按10000r•min-1离心10min，取上清液，加入双蒸水配成甲醇浓度为20％的溶液，置于冻干瓶中冷冻干燥，于检测前向冻干瓶中加入400μL甲醇，旋涡震荡3min，按10000r•min-1离心5min，取上清液进样测定。
2.4毒代动力学实验取SD大鼠，6只，雌雄各半，体重（280±20）g。灌胃附子总生物碱，折算成乌头碱、新乌头碱、次乌头碱剂量为：乌头碱0.3112mg/kg，新乌头碱3.912mg/kg，次乌头碱1.3096mg/kg，灌胃后分别于3、5、10、20、30、60、90、120、240、360、540、720min断尾取血0.5mL，肝素钠抗凝，离心后取血浆，按上述“2.3”处理样品，将处理后样品按“2.1”项下检测条件测定样品。
3实验结果
3.1方法专属性取空白血浆、空白血浆+对照品、血浆样品按“2.3”处理，与对照品，按“2.1”项下检测条件测定，考察方法的专属性。结果见图1~3。
结果表明，空白血浆MRM扫描图中与空白血浆+对照品和血浆样品MRM扫描图比较无相关离子检测峰存在，说明专属性良好。
3.2标准曲线及灵敏度分别取大鼠空白血浆200μL，加入适当的浓度的乌头碱、新乌头碱、次乌头碱对照品溶液10μL配制成用于绘制标准曲线的血浆样品，这些血浆样品分别按“2.3”方法处理后进样测定，记录峰面积。以乌头碱、新乌头碱、次乌头碱对照品在血浆样品中的浓度（c）对峰面积（Y）进行加权（1/c2）最小二乘法计算。结果表明乌头碱在27~270ng/mL范围内成良好的线性关系，线性方程为：Y=273.56c-13242.8，r=0.9974，LOD及LOQ分别为4.5、9ng/mL；新乌头碱在10.4~312ng/mL范围内成良好的线性关系，线性方程为：Y=159.23c-3038.1，r=0.9953，LOD及LOQ分别为5.2、10.4ng/mL；次乌头碱分别在13.2~132ng/mL和132~518ng/mL范围内成良好的线性关系。线性方程分别为Y=2.1433c+82.304，r=0.9984和Y=10.4033c-614.043，r=0.9963，LOD及LOQ分别为6.6、13.2ng/mL。
3.3回收率分别取大鼠空白血浆200μL加入一定量的乌头碱、新乌头碱、次乌头碱对照品溶液，分别配制成54、27、10.8，62.4、20.8、10.4，396、132、13.2ng/mL浓度的乌头碱、新乌头碱、次乌头碱血浆样品，按“2.3”处理后，分别测试，计算回收率。乌头碱的血浆样品的回收率分别为97.89±2.63％、95.63±3.56％和91.48±5.00％；新乌头碱的血浆样品的回收率分别为97.31±2.27％、95.24±3.56％和94.71±3.46％；次乌头碱的血浆样品的回收率分别为97.47±3.23％、97.73±3.89％和96.97±5.68％。均符合定量分析的要求。
3.4精密度和准确度分别取大鼠空白血浆200μL加入一定量的乌头碱、新乌头碱、次乌头碱对照品溶液，分别配制成54、27、10.8、62.4、20.8、10.4、396、132、13.2ng/mL浓度的乌头碱、新乌头碱、次乌头碱血浆样品，按“2.3”处理后，分别测试，进行日内精密度试验，另外取上述制备好的样品，间隔时间做3日内的日间精密度试验。乌头碱：日内精密度为3.6％、4.2％、5.5％；日间精密度为2.4％、2.7％、4.5％。新乌头碱：日内精密度为1.9％、4.1％、3.7％；日间精密度为2.4％、3.1％、4.4％。次乌头碱：日内精密度为2.9％、3.1％、2.8％；日间精密度为2.6％、3.3％、4.7％。结果精密度符合要求，测定方法可靠。
3.5毒代动力学参数按2.4项下的实验方法，分别得到不同时间点的血药浓度。将药时数据用中国药理学会3p97药代动力学程序进行自动拟合处理。以理论血药浓度值与实验测定值的相关系数最大和AIC最小作为判断标准。结果：乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的药动学曲线经拟合均符合口服给药的二室模型，药物浓度-时间曲线见图4，主要药动学参数见表1。将乌头碱、新乌头碱、次乌头碱按时间点绘制药-时曲线图，对比体内代谢的变化，见图7。
4讨论
研究表明，在灌胃给药后10min，乌头碱即达最高血药浓度，此后血药浓度快速下降，在30min下降到10min的一半左右，此后在60、360min出现了多峰。在灌胃给药后20min，新乌头碱即达最高血药浓度，此后血药浓度总体缓缓下降，但在90、360min出现了多峰。在灌胃给药后20min，次乌头碱即达最高血药浓度，此后血药浓度快速下降，在30min下降到20min的一半左右，此后在60、120min出现了多峰。提示乌头碱类双酯型生物碱口服后吸收很快入血，且分布迅速，然后出现多峰现象，血药浓度缓慢下降。
因为乌头碱类双酯型生物碱毒性、药效相似，故将新乌头碱、乌头碱、次乌头碱同一时间点的血药浓度相加，绘制药时曲线，观察大鼠口服乌头碱类双酯型生物碱后总浓度在血液中的动态变化（见图5）。
结果表明：在灌胃给药后20min，乌头碱类双酯型生物碱总血药浓度达最高，此后血药浓度快速下降，在30min下降到20min的3/4左右，此后在60、120、240min出现了多峰。总体趋势是30~360min血药浓度相对稳定，然后呈缓缓下降趋势。提示大鼠口服附子总生物碱后，吸收迅速，然后快速分布，30~360min保持相对稳定血药浓度，而后血药浓度呈缓缓下降趋势。
预实验发现，超过本研究所用给药剂量，多数动物在30min之内死亡，死亡前出现喘息、唾液分泌过多、鼻分泌物增多，尿失禁现象。死亡后解剖动物，肉眼观察发现肝脏呈黑紫色，肺表面出现大量出血点。按以上剂量给药，动物虽然不致死亡，但在15min左右出现了喘息、呼吸频率减慢、鼻分泌物增多、运动失调、异常运动、俯卧、震颤，尿失禁，唾液分泌过多、流涎等现象，这些现象在30min后逐渐得到缓解，呼吸渐趋正常，自主活动也较前严重中毒时增加但仍有中毒的反应存在。
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图60~30min总生物碱药-时曲线图[KH*3]
观察乌头类有毒中药生物碱30min内的药-时曲线（见图6），可见乌头类有毒中药生物碱总量在20min内快速上升，然后快速下降，特别是乌头碱和次乌头碱表现更为明显。提示动物在30min内出现的中毒反应与乌头类有毒中药生物碱总量的血药浓度快速上升有关，而30min后逐渐缓解与其血药浓度快速下降有关。其后乌头类有毒中药生物碱总量的血药浓度出现多峰现象，并在一定范围内相对平稳，使动物在一段时间内保持轻度中毒的状态。证实了乌头类有毒中药生物碱的血药浓度与中毒反应的产生具有直接相关性。
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（收稿日期：2010-12-07）
