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【摘要】 目的 通过观察“百会”透“曲鬓” 头针疗法对急性脑出血大鼠脑组织中MMP-9表达的影响来揭示对脑损伤拮抗作用的相关机制。方法 选取健康雄性Wistar大鼠160只随机分为三组:模型组、针刺组、西药组,每组50只大鼠,每组再随机分为6 h、1 d、2 d、3 d、7 d五个亚组,每个亚组10只大鼠;制备脑出血模型;另设10只正常大鼠作为空白组。针刺组针刺患侧“百会”透“曲鬓”穴。运用免疫组化方法检测各组大鼠脑组织中MMP-9阳性细胞的表达。结果 各造模组大鼠术后均出现不同程度的MMP-9阳性细胞表达增多现象。模型组大鼠术后6 h即出现明显的MMP-9表达增加;2 d时达高峰;3 d时出现缓慢下降;7 d时MMP-9表达仍高于空白组。针刺组MMP-9阳性细胞表达低于模型组和西药组,与模型组比较在相同时间点均差异有统计学意义(P[1]。目前寻找一种切实可行的拮抗脑出血急性期脑损伤从而促进脑出血后神经功能修复与重塑的临床方法已成为医学领域的研究热点。本实验通过自体血注入法制备脑出血大鼠模型;针刺组大鼠针刺患侧百会透曲鬓穴;运用免疫组化等检测方法,动态观察不同时间点针刺头部腧穴对脑组织中MMP-9阳性细胞表达的影响,探讨针刺头部腧穴对脑出血大鼠脑损伤的拮抗作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 设计 随机对照动物实验
1.1.2 单位 内蒙古民族大学医学院,哈尔滨医科大学第一临床医学院神经内科,黑龙江中医药大学实验中心(备有相应仪器设备)。
1.1.3 动物 实验于2007-09-25在黑龙江中医药大学实验中心(省级重点实验室)完成。健康雄性Wistar大鼠160只,体质量(350±20)g,由哈尔滨市兽医研究所提供(符合国家二级动物标准,动物质量合格证书号:SCXK(黑)20060021)。大鼠的饲养环境湿度45%~65%,温度22℃~25℃。
1.1.4 设计、实施、评估者 设计为第一、第二作者;干预实施为全部作者;评估为第二作者和黑龙江中医药大学的程为平教授,均受过专业训练,未采用盲法评估。
1.2 方法
1.2.1 动物分组 健康雄性Wistar大鼠160只,体质量(350±20)g。实验前正常饲养1周。造模前禁食12 h,禁水6 h。随机分为三组:模型组、针刺组、西药组,每组50只大鼠;每组再随机分为6 h、1 d、2 d、3 d、7 d五个亚组,每个亚组10只大鼠;制备脑出血模型;另设10只正常大鼠作为空白组。
1.2.2 模型制备 根据大鼠脑立体定位图谱[2]确定右侧尾壳核(caudate-putamen nucleus,CPu)位置。参照Rosenberg等[3]报道的方法制作脑出血大鼠模型。将大鼠用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉,俯卧位固定于立体定位仪上,使上门齿钩平面比耳间线平面低2.4 mm,这样大鼠前囟和后囟在同一水平面上。取头皮正中,备皮消毒,正中切口,长度约1 cm,骨膜剥离器剥离骨膜,暴露前囟及冠状缝,取前囟点(Bregma)点右旁开3.5 mm,后0.2 mm定点,用牙科钻钻直径为1.0 mm的圆孔,深达硬脑膜表面,鼠尾酒精消毒,距尾端3 cm处剪断鼠尾,用微量注射器取血50 μl,将微量注射器固定于立体定位仪上,沿钻孔垂直进针约6 mm,将未肝素化的血液50 μl以25 μl/min速度推进尾壳核,留针约2 min,缓慢出针。留针期间酒精棉球包扎鼠尾断端伤口。术后局部喷洒庆大霉素,用牙科水泥封闭颅骨创口,缝合头皮,局部皮肤采用碘酚消毒,防止局部感染影响指标观察。
1.2.3 筛选成功模型的方法 大鼠造模完成待大鼠清醒,采用Berderson[4]评分法筛选成功模型动物。根据Berderson神经体征评分法:轻抓尾巴,提起高于桌面10 cm,正常大鼠前爪伸直。0分:无神经功能缺损;1分:脑部病变对侧腕关节、肘关节屈曲,肩内收屈曲;2分:上述体征+向麻痹侧推阻力下降;3分:活动时向麻痹侧打圈(呈追尾状)。大鼠造模完成选择苏醒后出现上述症状和体征的大鼠,或造模后在其相应时间段内出现相似的神经功能缺损的症状和体征,经取脑证实内有明确血肿,视为脑出血模型成功者进行实验。否则视为失败,弃之不用。
1.2.4 实验动物的干预方法 针刺组针刺患侧“百会”透“曲鬓”穴,30 min/1次,1次/d。针刺方法:大鼠捆绑固定,用28号1寸毫针针刺患侧百会穴透曲鬓穴,取穴方法参照华兴邦等[5]制定的《实验动物穴位图谱》,进针0.8寸,留针30 min,期间捻转3次,每次5 min,以200转/min速度捻针。西药组给予忆立福稀释液1 ml灌胃(按人:大鼠体质量为200:1配置)治疗,3次/d。模型组大鼠于脑出血造模及评分后,给予大鼠类针刺组相同捆绑30 min/d;类西药组生理盐水1 ml灌胃,3次/d。空白组不做任何干预。
1.2.5 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计。计量数据以x±s表示。各实验组间以及时间点的比较采用均值比较,一维方差分析,因子和因变量列,进行方差齐性检验。以P0.05)。西药组与模型组比较,除6 h时间点(P>0.05),其余时间点差异均有统计学意义(P 3 讨论
头穴透刺对脑出血大鼠脑组织MMP-9表达影响的探讨。
基质金属蛋白酶(matrix metallproteinases,MMPs)是一类Zn��2+�依赖的中性蛋白酶[6],参与体内生理和病理过程,正常情况下与金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)共同存在处于动态平衡。它在中枢神经系统疾病的炎性反应中有很强的破坏作用,通过攻击脑血管的基底膜和破坏血脑屏障,导致ICH和脑水肿,并对神经元有不同程度的毒性作用[7]。
在Silva等[8]的一项多中心前瞻性研究中,对183例发病12 h内的原发性ICH患者进行观察,发现有54例(29.5%)患者出现血肿扩大,并且发现在出血早期血肿扩大的患者中血浆IL-6、TNF-a、MMP-9、c-Fn(细胞纤维粘连蛋白)均显著升高。由此可见,MMP-9参与了早期ICH的血肿扩大。Wang等[9]应用胶原酶诱导ICH模型时发现,明胶酶的活性与神经元和血管基底膜的内皮细胞有关。广谱的MMPs抑制剂GM6001可改善凝胶酶的活性,抑制中性粒细胞的浸润及氧化应激产物的释放、脑水肿及神经元的变性,且神经功能缺损及脑组织损伤体积均有改善。从而认为MMP-9在ICH后的最初3 d对脑组织有损害作用,抑制MMP-9的活性可作为有效的ICH的治疗手段。尽管目前对MMPs、TIMP和脑血管病关系的研究资料还十分有限,但已明确:MMPs和TIMPs平衡关系的失调参与了缺血性和出血性脑损伤的机制。脑缺血和(或)再灌注时,MMP主要通过促进基质降解导致出血、脑水肿形成和白细胞浸润;脑出血时MMPs则促进血肿周围血管源性脑水肿的形成和发展。给予外源性TIMP或MMP抑制剂可减轻缺血性脑损伤,减轻脑出血后的血管源性脑水肿,促进神经功能改善,因此人为的调节MMPs和TIMPs的平衡,如抑制或拮抗MMPs,增强TIMPs的功能和活性,有望成为治疗脑血管病的新途径。
作者分析认为:脑出血后在血肿周围存在明显的毛细血管内皮细胞MMP-9阳性反应性增多,表明MMP-9通过过度降解基底膜的ECM成份而使ECM降解的正常平衡被破坏,从而导致多种病理过程的发生。针刺能抑制内源性MMP-9表达,表明针刺可能通过抑制内源性MMP-9合成和分泌,减轻脑出血后MMP-9导致的相关损害。作者推测其机制可能为:针刺可能通过抑制内源性MMP-9合成和分泌,在某种程度上降低或减弱MMP-9相关信号传导途径,减轻MMP-9导致的基质降解、BBB开放、血管源性脑水肿形成、白细胞浸润、早期ICH的血肿扩大以及继发脑损伤,发挥拮抗脑水肿及脑损伤作用;针刺也可能有抑制剂作用而抑制MMP-9的活性,改善凝胶酶的活性,抑制中性粒细胞的浸润及氧化应激产物的释放、脑水肿及神经元的变性,从而拮抗脑损伤;针刺也可能通过调控MMPs和TIMPs平衡关系达到降低MMP-9的损害性;其相关机制还有待进一步研究。得出结论:头针疗法在脑出血急性期可能通过抑制内源性MMP-9表达发挥拮抗脑水肿及脑损伤作用;针刺组疗效优于西药组。
参 考 文 献
[1] 吴江,贾建平,崔丽英,等.神经病学.人民卫生出版社,2006:170.
[2] 包新民,舒斯云.大鼠脑立体定位图谱.人民卫生出版社,1991:35-40.
[3] Rosenberg CA,Mun-bryce S,Wesley M,et al.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats.Stroke,1990,21:801.
[4] Berderson JB,Pitts LH,Tsuji M,et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of neurologic examination.Stroke,1986,17:472-476.
[5] 华兴邦.大鼠穴位图谱的研究.实验动物与动物实验,1991,(1):1.
[6] Rosenberg GA.Matrix metalloproteinases in neuroinflamation.Glia,2002,8(39):279-280.
[7] Rosenberg GA,Estrada EY,Dencoff JE.Matrix metalloproteinases and TIMPsareassociated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain.Stroke,1998,29:2189-2195.
[8] Silva Y,Leira R,Tejada J,et al.Molecular signatures of vascular injury are associated with early growth of intracerebral hemorrhage.Stroke,2005,36(1):86-91.
[9] Wang J,Tsirka SE.Neuroprotection by inhibition fo matrix metalloproteinases in a mouse model of intracerebral haemorrhage.Brain,2005,128(Pt)7:1622-1633.
