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【摘要】 目的 研制低浓度的环孢素眼用乳剂,并建立该制剂的质量控制方法。方法 采用羟丙甲纤维素为增稠剂,按处方制备低浓度的环孢素眼用乳剂,用高效液相色谱法测定环孢素的含量,观察家兔眼部刺激性,并对制剂的稳定性进行考察。结果 环孢素在5~60 mg/L浓度范围内线性关系良好(r=0.9999),平均回收率为 100.39%,相对标准偏差(RSD)为 1.15%。滴眼后无刺激性,而且稳定性较好。结论 该制剂制备工艺简单,含量测定方法简便、准确,质量稳定,对眼部无刺激性,是一种较理想的眼用制剂,可用于干眼症及其他眼部免疫性疾病的治疗。
【关键词】
环孢素;眼用乳剂;制备;质量控制
Preparation and quality control of ciclosporin ophthalmic emulsionWANG Yan-dong,CHEN Mao-ling,YE Cheng-tian,et al.Zhongshan Ophthalmic Center,Sun Yat-sen University,Guangdong,Guangzhou 510060,China
【Abstract】 Objective To prepare low concentration ciclosporin ophthalmic emulsion and establish its quality control methods.Methods Low concentration ciclosporin ophthalmic emulsion was prepared by means of the formula.Hypromellose was used as thickening agent and the content of ciclosporin was determined by HPLC.Stimulus of ciclosporin on rabbits’ eye and the stability of low concentration ciclosporin ophthalmic emulsion were observed.Results The calibration curve of ciclosporin was linear within the concentration range of 5~60 mg/L,r=0.9999.The average recovery of ciclosporin was 100.39%,(RSD=1.15%).Ciclosporin had no stimulus on rabbits’ eye and its stability was very good.Conclusion The preparation is simple,its content determination is convenient and accurate,quality is stable,and it has stimulus on eyes.It is an ideal ophthalmic preparation and can be used to cure dry eyes and other ophthalmic immune diseases.
【Key words】
Ciclosporin;Ophthalmic emulsion;Preparation;Quality control
干眼症是最常见的眼表疾病之一,严重干眼症患者可引起视力明显下降而影响工作和生活,甚至导致失明,长期以来无特效疗法[1,2]。炎性反应和细胞凋亡等因素共同参与了干眼症的发病过程,目前主要有效的治疗方法是抗炎和免疫抑制治疗,应用糖皮质激素滴眼,因其引起的眼压升高、视网膜病变等并发症而限制了它的使用[3]。而环孢素通过减少T 淋巴细胞浸润、下调炎症因子及抑制泪腺和结膜上皮细胞的凋亡而发挥治疗作用,已成为近几年来干眼症防治领域研究的热点[4]。目前国内外采用的环孢素眼局部制剂多存在眼内通透性差、不稳定、刺激性大等不良反应而限制了此药的临床应用。本研究在作者研制的医院制剂1%环孢素滴眼液配制工艺流程的基础上,进一步优化处方、改进制剂工艺及降低剂量,研制了单剂量包装的低浓度环孢素眼用乳剂,现将结果报告如下。
1 仪器与试药
Agilent 1100高效液相色谱仪,包括G1314A紫外检测器,G1311A四元泵,G1316A柱温箱,G1322A真空脱气机,G1329A带温控自动进样器(美国Agilent公司);Agilent化学工作站。
环孢素对照品(中国药品生物制品检定所,批号:130495-200202),环孢素原料药(杭州中美华东制药有限公司,批号:080101HB),羟丙甲纤维素(美国陶氏化学公司,批号:UL31012N03),乙腈和甲醇为色谱纯,其他试剂均为分析纯,水为注射用水。动物采用健康合格一级新西兰家兔(广东省
基金项目:广东省医院药学研究基金项目(项目编号:2009B008)
作者单位:510075广州,中山大学中山眼科中心
医用动物实验中心提供),公兔、母兔兼有,体质量2~3 kg。
2 制备工艺
2.1 处方 环孢素0.05 g,羟丙甲纤维素1.0 g,乙醇0.2 ml,氢化蓖麻油0.4 ml,吐温-80 0.1 ml,甘油0.1 ml,灭菌注射用水加至100 ml。
2.2 制备 在无菌条件下,用热注射用水约60 ml分散溶解羟丙甲纤维素,放冷;将环孢素加入乙醇搅溶,依次加入氢化蓖麻油、吐温-80、甘油,搅拌混匀,再加入已溶解好的羟丙甲纤维素,加灭菌注射用水至全量,搅匀,100℃ 流通蒸汽灭菌,无菌分装至每支0.4 ml的单剂量包装,即得。
3 质量控制
3.1 性状 本品为微粘稠的乳白色液体。
3.2 鉴别 取本品,照含量测定项下的方法试验,供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致。
3.3 检查
3.3.1 pH值应为6.0~7.0。
3.3.2 渗透压比应为0.9~1.1。
3.3.3 其他 应符合眼用制剂项下的各项规定。
3.4 含量测定
3.4.1 色谱条件及方法的专属性考察 色谱柱:Eclipse XDB-C8柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相:乙腈-甲醇-水(67.5:5:27.5);流速为0.8 ml/min;检测波长为 210 nm;柱温为 55℃;进样量为 20 μl。在上述色谱条件下测定,分别记录空白样品溶液、环孢素对照品溶液以及环孢素眼用乳剂样品液HPLC图谱,见图1,环孢素的保留时间约为10.8 min,主药峰与基质峰分离良好,峰形对称,空白基质不干扰环孢素的测定。
3.4.2 标准曲线制备 精密称取环孢素对照品 25.00 mg,置 50 ml量瓶中,加少量甲醇溶解后,加流动相稀释至刻度,摇匀,作为储备液。精密量取储备液 0.5、1、2、3、4、5、6 ml,置 50 ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,滤过,分别取溶液 20 μl注入色谱仪,记录色谱图,量取峰面积。将峰面积(Y)与质量浓度(X)做线性回归,得环孢素的线性回归方程为:Y=119.6419X-18.4243,相关系数r=0.9999。结果表明,环孢素在 5~60 mg/L浓度范围内,呈良好的线性关系。
3.4.3 回收率试验 按本品制剂处方,配制低(10 mg/L)、中(20 mg/L)、高(40 mg/L)三种含量模拟内容物,每个浓度配制3份,分别测定其含量,计算回收率,结果见表1。
3.4.4 精密度实验 按本品制剂处方,配制低(10 mg/L)、中(20 mg/L)、高(40 mg/L)三种含量模拟内容物,并于日内的不同时间和不同的日间分别进样 5次,计算日内精密度分别为0.12%、0.06%、0.06%,日间精密度分别为 0.36%、0.23%、0.05%。
3.4.5 样品重现性实验 精密量取同一批号样品 6 份,照“3.4.7”项下方法测定其含量并计算,环孢素的含量为(101.18 ± 0.41)%,RSD为0.29%。
3.4.6 稳定性试验 取浓度为 20 mg/L的环孢素对照品溶液,分别于0、2、4、6、8、12、24 h测定其峰面积,计算其RSD为 0.90%。结果表明,对照品溶液在 24 h内稳定。
3.4.7 含量测定 精密吸取环孢素眼用乳剂 2 ml,置 50 ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,滤过,进样 20 μl。另精密称取环孢素对照品适量,配成 20 mg/L的溶液作为对照品溶液,同法测定,按外标法以峰面积计算,本品含环孢素应为标示量的 90%~110%。结果见表2。
3.5 无菌检查 按中国药典规定进行检测,结果应无菌生长。
3.6 刺激性试验 选体质量 2~3 kg 成年健康家兔5只,每天分别于每只家兔的一侧眼结膜囊中滴入 0.1 ml环孢素眼用乳剂,另一侧滴入 0.1 ml生理盐水,给药后使兔眼被动闭合 10 s,记录单次给药后6、24、72 h至 7 d 以及连续给药 7 d(3次/d)兔眼的局部反应情况。根据文献[5]标准评分,结果表明本品无刺激性,眼用安全。
3.7 稳定性考察 取3批样品,在温度(25±2)℃,相对湿度(60±10)%的条件下放置12个月,每3个月取样1次,分别于0、3、6、9、12个月末取样按眼用制剂稳定性重点考察项目进行检测。与0月相比,其性状、含量、pH值、无菌检查等各项指标均未见明显变化。
4 讨论
国内外治疗干眼亦有采用环孢素眼用凝胶、滴眼液进行动物实验和临床前研究,但环孢素眼用凝胶和滴眼液均存在眼内通透性不好、前房药物浓度较低、有短时间的视力模糊,并且滴眼液滴眼后多余蓖麻油溶剂易从眼角流出,对内外眦皮肤造成刺激等不良反应,而且环孢素药液的刺激性除了与溶剂有关外,同时也与药物浓度呈正相关[6]。Baudouin等[7,8]的研究表明,经局部滴用0.05%~0.1%环孢素眼用凝胶,干眼症患者眼表面炎性反应标志物IL-6、CD11a及HLA-DR的表达明显降低,杯状细胞密度明显增加。因此本制剂中环孢素的浓度选用0.05%。
本处方是在原有医院制剂的基础上研制的,原处方因环孢素只溶于油,用蓖麻油配制,其浓度和pH值不宜调至适宜范围,且蓖麻油本身的刺激性和眼内通透性差等缺点而限制了此药的临床应用。故本研究改变其剂型,制成环孢素眼用乳剂;加入氢化蓖麻油、吐温-80、甘油等辅料作为增溶剂,促进环孢素的溶解,并增加其稳定性;同时选用羟丙甲纤维素作为增稠剂,能够增加药液的黏稠度,使环孢素在眼内的滞留时间延长,从而增加了环孢素在眼内的吸收;未添加蓖麻油,避免了它对眼部的损害。
因干眼症患者的泪膜和泪道系统通常处于非正常状态,泪液动态交换速率较正常人慢;因此,患者不能在短时间内通过分泌泪液稀释药物中的抑菌剂,从而延长了抑菌剂在眼表的停留时间,在频繁、长期使用时会造成眼表损害[9]。因此本制剂采用单剂量包装,未添加任何抑菌剂,从而避免了抑菌剂对眼表的损害。
采用该色谱条件测定环孢素的含量,峰形较好,主成分峰分离较好,具有良好的专一性,测定结果稳定,回收完全。而且该制剂制备工艺简单,质量稳定,对眼部无刺激性,是一种较理想的眼用制剂,可用于干眼症及其他眼部免疫性疾病的治疗。
参 考 文 献
[1] Abelson MB,Walker P,Ousler GW.Dry Eye Diagnosis:It’s All a Blur.Review of Ophthalmol.2006,13(12):50.
[2] Barabino S,Dana MR.Dry eye syndromes.Chem Immunol Allergy,2007,92:176.
[3] Pflugfelder SC.Anti-inflammatory Therapy of Dry Eye.Ocul Surf,2003,1(1):31.
[4] Matsuda S,Koyasu S.Mechanisms of action of cyclosporine.Immunopharmaco,2000,47(2-3):119.
[5] 章元沛.药理学试验.人民卫生出版社,1996:222.
[6] Wilson SE,Perry HD.Long-term Resolution of Chronic Dry Eye Symptoms and Signs after Topical Cyclosporine Treatment.Ophthalmol,2007,114(1):76.
[7] Perry HD,Donnenfeld ED.Topical 0.05%cyclosporin in the treatment of dry eye.Expert Opin Pharmaco Ther,2004,5(10):2099.
[8] Baudouin C,Brignole F,Pisella PJ,et al.Flow cytometric analysis of the inflammatory marker HLA-DR in dry eye syndrome:results from 12 months of randomized treatment with topical cyclosporin A.Adv Exp Med Biol,2002,506(Pt B):761.
[9] 宁黎丽.眼用制剂研发过程中应关注抑菌剂的合理使用和质量控制.中国药学杂志,2007,42(23):1836.
