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【摘要】 目的 研究蟾毒灵对裸鼠人胰腺癌的疗效及细胞凋亡的作用和机理。方法 建立裸鼠人胰腺癌模型，随机分为对照组（NS）、5-氟尿嘧啶组（5-Fu）、蟾毒灵低剂量组（Bu L）、蟾毒灵高剂量组（Bu H）。分别腹腔注射生理盐水 NS，20 ml/kg、5-Fu 24 mg/kg、Bu 1 mg/kg、Bu 1．5 mg/kg。用药后第7天处死，计算肿瘤生长抑制率；TUNEL 法检测瘤体凋亡指数；免疫组化S-P法检测P38、TGF-β1的表达。结果 治疗后与NS组相比，各组瘤体体积均显著缩小（P［1，2］。但其治疗胰腺癌尚未见报道，本文观察蟾毒灵对裸鼠人胰腺癌的治疗作用，并从蟾毒灵诱导人胰腺癌细胞凋亡及其对TGF-β1信号转导的影响探讨其治疗胰
腺癌的机制。
1 材料和方法
1．1 实验动物
BALB/C,裸鼠80只，4～5周龄，雌
雄各半，于SPF级动物实验室内的超净生物层流架中恒温无菌饲养。
1．2 主要药物
5-氟尿嘧啶5-Fu注射液（批号：050908，上海旭东海普药业有限公司，�10 ml�∶�0．25 g）�、蟾毒灵购自美国Sigma公司，剂型为粉针剂，�10 mg/�支。
1．3 主要仪器和试剂
CO�2恒温培养箱，德国Heraeus Instruments公司；超净工作台，苏州净化仪器厂；倒置显微镜，日本Olympus公司；DMEM细胞培养基干粉，美国GIBCO公司；新生牛血清，500 ml，美国GIBCO公司；胰蛋白酶，美国Sigma公司。
1．4 细胞株来源与培养
人胰腺细胞株SW1 900，由上海中医药大学分子与细胞培养室提供，常规复苏传代培养。在37 ℃, 5% CO�2:饱和湿度条件下，培养于含10%灭活的小牛血清、RPMI 1 640培养液中。体外培养至对数生长期时，离心、磷酸盐缓冲液洗涤，配制成1×10�7个/ml。
1．5 荷瘤小鼠模型的建立 ①细胞接种：取4～6周龄BALB/C 裸鼠5只，体质量(20±2)g，雌雄各半。常规接种裸鼠背部近右上肢皮肤，注入0．2 ml制备好的单细胞悬液，细胞数约为2×10�6。隔离鼠笼内SPF条件下，恒温恒湿饲养;②组织块接种：经过5～7 d的潜伏期，裸鼠皮下肿瘤生长至�1～1．2 cm�，将供瘤鼠脱颈椎处死。沿移植瘤包膜小心剥离皮下肿瘤组织。取肿瘤边缘的新鲜肿瘤组织，眼科剪剪成直径1 mm×1 mm×1 mm大小组织块，置于生理盐水中备用。在超净台用20 g套管针接种于裸小鼠背部皮下。受体裸小鼠继续饲养于层流柜中。待皮下肿瘤直径约0．5 cm，即可作为模型用。
1．6 实验分组和给药
荷瘤鼠随机分为4组:生理盐水（NS）组、化疗药(5-Fu)组、蟾毒灵低剂量(Bu L)组、蟾毒灵高剂量(Bu H )组，每组12只，以上各组均为腹腔注射，其中Bu H组1．5 mg/kg；Bu L组为1．0 mg/kg；5-Fu组为24 mg/kg； NS组给予生理盐水20 ml/kg，连续给药6 d，1次/d。
1．7 观察指标及方法 肿瘤生长抑制率：每组取6只，于治疗后第7天处死，游标卡尺测量瘤体最长径(a)和最短径(b),按公式计算肿瘤体积(V)的大小，根据公式V=12ab�2计算并比较各组肿瘤生长率。肿瘤生长抑制率:肿瘤生长抑制率=(对照组平均瘤体积-用药组平均瘤体积)/对照组平均瘤体积×100% 。
1．8 小鼠肿瘤凋亡检测 治疗后每组取6只小鼠的肿瘤标本以10%甲醛液固定，石蜡包埋，切片，采用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（Trminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling，TUNEL脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法）。光镜下观察切片的染色反应，结果判断标准［11］为避开坏死区以细胞核有明显棕黄色为阳性细胞。随机选10个高倍视野(×400)，借助网格记数器，细胞数>1 000个以上，计算TUNEL阳性标记指数（TUNELlabeling index, TUNEL-LI），即凋亡指数。
1．9 肿瘤组织中的TGF-β1检测方法
采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-1过氧化物酶(S-P)方法：石蜡切片脱蜡，柠檬酸盐煮沸热修复法进行抗原修复；加非免疫性动物血清50μl，室温孵育�10 min�。加一抗caspase-350 μl，4 ℃过夜。加通用型生物素标记羊抗兔IgG 50 μl, 37 ℃孵育�15 min�。加辣根过氧化物酶标记链亲和素50 μl, 37 ℃孵育�15 min�。加新鲜配置的DAB溶液100 μl，闭光显色3～�10 min�，显微镜下控制显色。自来水冲洗，苏木素复染。脱水，透明，中性树胶封固。每批染色均用已知阳性切片作阳性对照，用PBS液代替一抗作阴性对照。显微镜下观察，以细胞核或细胞浆呈棕黄（褐）色为阳性，阳性计数采用双盲法。染色判断标准：p38表达以胞核和(或)胞浆着色为阳性细胞。每张切片于高倍镜下(×400)任选10个视野，计数阳性细胞数（细胞数＞1 000），阳性表达率=(表达阳性细胞数/总细胞数)×100% ［3］。
1．10 统计方法 用SPSS11．0 统计软件包进行统计学分析，各组数据以均数±标准差(x±s)表示。
2 结果
2．1 各组荷瘤裸鼠肿瘤生长变化
治疗前各组瘤体体积差异无统计学意义(P>0．05 )，提示治疗前各组具有可比性。治疗后，各用药组与NS组相比瘤体体积明显缩小(P0．05 )；Bu H组较其他各组瘤体体积明显缩小（P0．05）；Bu H组与5-Fu组和Bu L组相比凋亡指数明显增高�（P［4］。蟾酥是重要的传统抗癌中药，临床用以治疗癌肿，至少有近千年历史。蟾酥具有显著的细胞毒性；在适当剂量内无免疫抑制作用及骨髓抑制作用，与放疗、化疗同用则有减毒增效的作用。
转化生长因子（TGF）β家庭是一类属结构相关蛋白的异二聚体多肽，至少包括三种（TGF-β1~3），其中TGFβ1是人体内的主要形式。TGF-β1为多效能生长因子，有研究显示胰腺癌中TGF-β1的过表达可能与蛋白激酶Ca(PKCa)的膜转运有关,而PKCa的膜表达在多药性耐药中发挥重要作用,检测胰腺癌组织中TGF-β1及PKCa的表达可能有助于对胰腺癌的化疗效果作出评价［5］。故胰腺癌中TGF-β1的表达异常与胰腺癌的发生发展密切相关。TGF-β1是抑制上皮细胞生长的多肽家庭族中的一员，有丝分裂原诱导的发生凋亡的组织内，TGF-β1前体表达明显增加，外源性的TGF-β1可诱导培养的肝细胞发生凋亡TGF-β1可促进体外培养的肝癌细胞中的DNA降解，TGF-β1通过与靶细胞上的受体结合，引起凋亡的发生。已有的研究发现TGF-β1对胰腺癌细胞凋亡以及细胞周期的具有重要影响这些均提示TGF-β1在细胞凋亡中起作用［6-8］。
本研究应用不同剂量蟾毒灵治疗人胰腺癌移植瘤裸鼠后，从治疗前后裸鼠人胰腺癌移植瘤生长变化来看，高剂量蟾毒灵组瘤体缩小最明显，而且明显优于单独化疗组和低剂量蟾毒灵组，提示蟾毒灵的抗癌作用与剂量成正相关。本研究中Bu组治疗后的凋亡指数明显升高，同时, 在Bu H组中TGF-β1表达明显低于其他各组, 提示蟾毒灵的抗癌作用与下调TGF-β1表达, 从而促进肿瘤的凋亡有关。根据本研究结果发现，蟾毒灵对人胰腺癌的抑制作用可能是通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡来发挥作用 ,但是其诱导胰腺癌细胞凋亡的明确的信号转导，还需进一步进行深入的研究。
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