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摘要：细胞培养技术是生物医学研究中最常用和最重要的技术之一，本文就心肌细胞的经典培养模型和新进展作一综述。
关键词：心肌细胞；细胞培养；三维培养
Abstract：Cell culture is one of the most commonly used and the most important techniques in the biomedical research. In this paper， the classical cardiomyocyte culture methods and the latest progress in this field are reviewed.
Key words：Cardiomyocyte；Cell culture；Three-dimensional cultivation
细胞是生物体结构和功能的基本单位，也是疾病发生和转归的基础。因此，细胞是生物医学研究中最重要的环节。在体细胞研究存在诸多局限性，如成本高、影响因素复杂、可重复性差等，为解决这些困难，离体细胞培养技术应运而生。细胞培养（cell culture）是细胞在离体条件下的克隆性增殖过程，具有成本低、周期短、数量多、单克隆性、条件可控等诸多优势。可以说，细胞培养技术是生物医学研究中最基础最重要的技术之一。本文仅就心肌细胞培养技术及其进展作一浅述。
1经典心肌细胞培养模型
鼠心肌细胞是心肌细胞培养最常用的材料，包括未成熟心肌细胞（immature cardiomyocyte，ICM）和成熟心肌细胞（adult cardiomyocyte，ACM）两种。ICM培养技术是由Harary等在1960年建立的[1]，经过后人改进形成了经典的Simpson培养法[2]。ICM主要来源于胚胎鼠和乳鼠，以出生3 d内的乳鼠心室肌细胞最常用。ACM相互间有大量闰盘和外基质紧密相连，又没有分裂增殖能力，其分离和培养比ICM要困难得多，直到上世纪60年代才通过逆行主动脉生物酶灌注法分离出单个ACM[3]，但是当时ACM因置于生理浓度钙溶液中而迅速死亡，这个现象被称为"钙反常（calcium paradox）"[4]。1976年， Powell首次报道了分离活性的钙耐受成熟心室肌细胞的技术[5]。Jacobson则在1977年首次成功培养出ACM。
经典的心肌细胞培养技术包括细胞分离、纯化、接种、培养和传代培养等步骤。
1.1心肌细胞的分离 ICM的分离一般采用组织块消化法，即将心肌组织剪成小碎块，然后加入消化分离液将心肌细胞和非心肌细胞分开。消化分离液的主要成分是生物酶，常用的有胰蛋白酶、胶原酶和透明质酸酶[6]，其中胰蛋白酶作用最强，但也最容易损伤心肌细胞；胶原酶作用温和；透明质酸酶作用弱，不宜单用。目前多采用两种或三种消化酶联合，以胰蛋白酶和胶原酶Ⅰ联合最常用。消化分离液中可加入牛血清白蛋白以保护心肌细胞，提高细胞质量[7]；也可加入脱氧核糖核酸酶，防止DNA聚积在心肌组织表面而影响分离效率[6，8]；乙二胺四乙酸（EDTA）是一种常用的螯合剂，能吸附溶液中的Ca2+、Mg2+等金属离子而促进细胞分离（细胞间粘附因子发挥作用需有上述金属离子存在），而且对细胞功能影响极小[9]，故加入EDTA可进一步提高分离效率，但是EDTA不能被血清中和，后续必须洗净，以免影响细胞贴壁。心肌细胞分离后加入含胎牛血清的培养液以终止消化，即得到初步的心肌细胞悬液[10]。在实际操作中，消化分离液的酶类、酶浓度、温度、搅拌转速及时间长短等因素相互影响、相互制约，需要反复摸索才能得到最佳方案。
ACM的分离方法相对更复杂，主要有组织浸泡法、贴块培养法和离体心脏生物酶灌注法。效果最好和最常用的是离体心脏生物酶灌注法，又称为Langendorff离体心脏灌注法，是Oscar Langendorff在1895年发明的[11]，经过预热、消毒、洗涤、经升主动脉逆灌消化酶溶液循环灌流、震荡释放心肌细胞和梯度复钙等步骤，最终得到活性的单个ACM[12，13]。
1.2心肌细胞的纯化 心肌组织由多种细胞构成，以心肌细胞和成纤维细胞样细胞数量最多。在体外培养的特殊环境中，非心肌细胞对心肌细胞的影响是巨大的，主要表现在：①非心肌细胞贴壁和生长增殖能力更强，容易成为优势细胞，通过空间竞争、分泌抑制因子等机制影响心肌细胞的生长增殖和功能[14，15]；②非心肌细胞对干预因素的反应与心肌细胞不同，影响实验结果。因此，细胞分离后的纯化是必要的。常用的纯化方法有差速贴壁法和化学试剂法，主要是除去成纤维细胞样细胞：①差速贴壁法利用不同细胞贴壁速度的不同（心肌细胞贴壁较慢）进行分离和纯化。通过差速贴壁法纯化的心肌细胞纯度可达到90%以上[16，17]，且操作简单、成本低、对心肌细胞影响小，但缺点是作用时间短，不能单独用于长时间培养的实验；②化学试剂法利用某些化学试剂对不同细胞的抑制强度不同来达到纯化目的。5-溴脱氧尿嘧啶核苷可明显抑制成纤维细胞样细胞增殖，而对心肌细胞影响小，是心肌细胞纯化常用的试剂[18，19]。化学试剂能够持续起作用，但缺点是对心肌细胞可能具有潜在影响。在实际操作中，差速贴壁法和化学试剂法常联用。
1.3心肌细胞接种和培养 细胞培养基分天然培养基和合成培养基两种，后者更常用。心肌细胞常用的培养基有DMEM、M199、MEM、EMEM等。为了促进细胞贴壁，培养基中可加入促吸附因子（Ⅰ型胶原、Ⅵ型胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白等）；为了预防细菌污染，有时加入抗生素[20]。细胞密度是影响细胞生长、增殖、分化表型、生存时间等的重要因素，接种密度需根据实验目的而定，如果是为了观察单个细胞的行为，密度宜较低，一般为1～2×105/mL；如果是为了获取细胞产物，密度则宜较高，一般为5～6×105/mL[21]。接种在多孔培养板时，应放弃周边孔并加入空白培养基以避免"边缘效应"。
ACM的培养比较复杂，分为去分化法和快速吸附法两种[22]。去分化法使用含血清培养基培养，研究表明[23]，通过该法培养的ACM在超微结构、分子水平和电生理水平表型上都发生了"去分化（dedifferentiation）（向胎儿表型的逆转）"，因此被称为"去分化法"。去分化法的优点是细胞存活时间较长，达数周到数月，缺点是发生了表型逆转而且逆转程度尚不明确[24]，也正因为如此，现在多采用快速吸附法。快速吸附法是将ACM接种在经促吸附因子预处理过的基质上，使用无血清培养基培养。ACM可在接种3 h内吸附到培养基质上，并且始终保持急性分离时的柱形、纹状形态，也不会自发性收缩，尤其适用于分子生物学和电生理试验[25]。快速吸附法的缺点是细胞存活时间较短，只有1～2 w。
1.4 ICM的传代培养 ICM具有分裂能力，为了调节细胞密度，有时需要传代培养。传代培养实质上是将原代细胞收集起来稀释后重新接种和培养的过程。由于心肌细胞是贴壁生长的，传代培养的关键是使细胞脱壁、分离成细胞悬液，分离方法主要有两种：①生物酶法：加入低浓度（0.01%～0.05%）胰蛋白酶溶液使细胞分离；②机械法：通过吸管的刮吹使细胞分离。
2心肌细胞三维培养技术
经典的心肌细胞培养模型，细胞接种在二维基质中，与在体的三维环境完全不同，势必导致细胞在结构和功能上发生一系列适应性改变，影响科学研究的效果。所以，人们迫切需要一种既能尽量保留在体细胞的结构和功能特点、又具有体外培养优势的技术。随着生物、材料、纳米、组织工程等学科的快速发展，细胞三维培养技术应运而生了[26]。
刘霞等用三维的PLGA泡沫支架材料培养乳鼠心肌细胞，观察到心肌细胞形成了心肌组织样结构，超微结构保持良好，代谢活性也较二维培养更高[27]。刘兴茂等将乳鼠心肌细胞接种于鼠尾胶原膜三维支架中培养，并与二维培养作横向比较，发现三维培养的心肌细胞保持了良好的形态和功能[28]。Eschenhagen等将鸡胚心肌细胞接种到胶原凝胶上，观察到心肌细胞形成了可收缩的网络结构[29]。Hussain等将乳鼠心肌细胞与成纤维细胞共同接种于经层粘连蛋白处理过的生物活性壳聚糖纳米纤维三维支架中，发现心肌细胞能长期维持在体的形态和功能，形成同步化收缩[30]。
总之，心肌细胞三维培养技术还方兴未艾，是未来的发展方向之一。
3结论
心肌细胞培养技术已走过半个多世纪的历史，广泛应用于电生理、信号通路、细胞凋亡以及药物安全性评价和新药筛选等领域，为生物医学的发展作出了巨大贡献。同时，随着三维培养、反义寡核苷酸和基因转染等新技术手段的涌现，心肌细胞培养技术又是历久弥新、蒸蒸日上，必将为人类的健康事业更立新功。
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编辑/丁一
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