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【摘要】 目的 探讨血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）对高浓度葡萄糖中培养的猴脉络膜-视网膜内皮细胞（RF/6A）的保护作用。方法 RF/6A分3组培养：对照组（DMEM培养基含25 mmol/L葡萄糖）、高糖组（DMEM培养基含40 mmol/L葡萄糖）、Ang-高糖组（DMEM培养基含40 mmol/L葡萄糖+0.25 mg/L Ang-1）。利用台盼兰染色法及MTT比色法检测体外培养的各种RF/6A存活率及细胞活力，利用western-blotting法检测各组suivivin表达。结果 1 d时各组细胞存活率及活力无差异。3、5、7 d时高糖组和Ang-高糖组细胞存活率及细胞活力均较正常组下降（P2，饱和湿度孵箱中培养，当细胞铺满细胞瓶底的90%后，以0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化，按照1∶2~1∶4进行传代分组培养：对照组（DMEM培养基含25 mmol/L葡萄糖）、高糖组（DMEM培养基含30 mmol/L葡萄糖）、Ang-高糖组（DMEM培养基含30 mmol/L葡萄糖+0.25 mg/L Ang-1）。
1.2.2 台盼兰检测细胞存活率 调整细胞浓度,以1×104/孔的密度接种于96孔板，每孔200 μl。检测前4 h换成相应的无血清培养基，每孔再加入MTT（5 mg/ml）20 μl，37℃孵育4 h后弃去孔内培养液,加入150 μl二甲基亚砜，振荡15 min使结晶物充分溶解。以空白孔调零，570 nm波长检测，630 nm波长校正，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值（A值），按公式计算实验组的细胞存活比例：细胞存活率=检测组A值/对照组A值×100%。
1.2.3 MTT比色法检测细胞活力 以1×104/孔的密度，将RF/6A接种于96孔板，每孔200 μl。培养至1、3、5、7 d时用0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化细胞，制成细胞悬液，与浓度为0.4%的台盼蓝溶液按照1:1比例混匀，室温下作用3 min后，于15 min内于血球记数板上计数呈蓝色细胞。根据下式计算细胞活力：（总细胞数-着色细胞数）/总细胞数×100%。
1.2.4 western-blotting检测survivin表达 实验组细胞培养5 d，去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍，加入裂解液后置于冰上15 min，以细胞刮收集细胞于EP管，超声（200 W）3 s×2次裂解细胞。以12 000 g，4℃离心2 min。取少量上清液进行定量，以牛血清蛋白(BSA)为标准品，采用考马斯亮蓝法，于酶标仪490 nm下测定光密度值(OD值)，计算提取总蛋白的浓度，将所有蛋白样品调至等浓度上样（上样前100℃水浴3 min），以80 V电压常规SDS-PAGE电泳后转移到硝酸纤维膜，用封闭液(1×TBST，5%脱脂奶粉) 4℃封闭过夜，再用抗体稀释液(1×TBST，1%脱脂奶粉)1∶250稀释一抗。与经封闭液处理的PVDF膜置于小封口塑料袋内37℃孵育2 h。1×TBST液洗膜3次，每次20 min。然后，以同样方法，1∶4500稀释二抗、37℃孵育1 h，1×TBST液洗膜3次，每次30 min。将膜置于含BCIP（33 μl）/NBT（66 μl）的染色液10 ml，于室温下轻轻摇晃，使蛋白条带逐渐显影、定影，胶片洗涤干燥，利用Kodak电泳图象分析系统对图片各电泳条带亮度进行扫描，对各组电泳条带的显影相对强度进行统计分析。
1.3 统计学方法 数据均采用（x±s）表示，利用SPSS 13.0统计软件进行方差分析及LSD-t检验，P
