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[摘要] 目的：研究林可霉素对于健康人外周血单核巨噬细胞表面分子表达的影响，探讨林可霉素对单核巨噬细胞免疫学功能的影响。方法：从健康人外周血中提取单核巨噬细胞体外培养，培养7 d后将其分为霉素处理组和对照组，林可霉素处理组加入林可霉素，对照组加入0.9%氯化钠溶液，刺激48 h后，流式细胞仪检测细胞表面CD80、MHCⅡ及Fas表达，ELISA法检测细胞培养上清液中细胞因子人干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α的浓度。结果：在林可霉素处理后，单核巨噬细胞抗原呈递相关分子CD80、 MHCⅡ表达降低，细胞因子IFN-γ、TNF-α表达明显减少，其表面死亡受体Fas表达升高。结论：林可霉素可明显抑制单核巨噬细胞抗原呈递及细胞因子分泌等免疫功能，并诱导单核巨噬细胞死亡。
[关键词] 林可霉素；免疫功能；巨噬细胞
[中图分类号] R97 [文献标识码]A[文章编号]1674-4721（2011）02（c）-０09－０3
The effect of lincomycin on the immune function of human peripheral blood-derived mononuclear macrophage cells in vitro
LI Feng1, LIU Hongjie2*
(1.The 95857 Military Hospital, Xiaogan City, Hubei Province, Xiaogan 432100, China; 2.Department of Gastrointestinal Surgery, the First People"s Hospital, Guangzhou City, Guangdong Province, Guangzhou 510510, China)
[Abstract] Objective: To investigate the effect of lincomycin on the surface molecules expression level of human peripheral blood-derived mononuclear macrophage cells in vitro. Methods: Macrophage cells were extracted in vitro from peripheral blood of health volunteers and incubated with lincomycin for 48 h, the variation of CD80, MHCⅡ and Fas were detected with flow cytometric analysis, and the secretion of IFN-γ and TNF-α by macrophage cells were detected with ELISA. Results: The lincomycin decreased the expression of antigen-presenting factor CD80, MHCⅡ of macrophage cells and their production of IFN-γ, TNF-α, and increased the Fas expression on the cells. Conclusion: Lincomycin inhibits immune function of the macrophage cells, and induces their death.
[Key words] Lincomycin; Immune function; Macrophage
林可霉素是一种临床常用药，对G+菌及部分厌氧菌有明显杀菌作用，然而，目前发现其对机体整体免疫功能有明显的抑制作用[1]。本研究针对免疫系统中起关键作用的单核巨噬细胞进行研究，从健康人外周血培养骨髓DC，经林可霉素刺激48 h，探讨其对小鼠DC的表面共刺激分子以及免疫功能的影响。
1 材料与方法
1.1 材料及主要试剂
健康人外周血来自于20～25岁健康志愿者；人重组M-CSF购自Peprotech，PE标记的鼠抗人MHCⅡ（HLA-DR）抗体（同型对照为PE标记小鼠IgG2a），PE-鼠抗人CD80（同型对照为PE标记小鼠IgG2b），人干扰素-γ（IFN-γ），肿瘤坏死因子α（TNF-α）细胞因子，ELISA检测试剂盒均购自美国ebioscience公司；PE标记鼠抗人Fas（同型对照为PE标记小鼠IgG1）购自美国Biolegend公司；完全培养基RPMI1640购自美国hyclone公司；胎牛血清购自Gibco公司。
1.2 方法
1.2.1 人外周血单核巨噬细胞培养参照文献方法[2]，应用淋巴细胞分离液分离健康人外周血，Tris-NH4CL破红，RPMI1640洗2次，以含10%FCS、20 ng/ml mGM-CSF RPMI1640完全培养基重悬细胞，以106细胞/孔加入六孔板培养。置于37℃、5% CO2孵育箱中，培养3 d后轻轻吸取培养基和上层悬浮细胞。隔日半量换液至第7天。
1.2.2 实验分组及细胞处理将培养第7天的细胞分为两组，①对照组：培养液加0.9％氯化钠溶液；②林可霉素处理组：培养液加林可霉素5 μg/ml。孵育48 h后保留细胞悬液。
1.2.3 单核巨噬细胞表型改变收集细胞调整密度为1×106/ml，加入PE标记鼠抗人CD80（同型对照为PE标记小鼠IgG2b），PE标记鼠抗人Fas（同型对照为PE标记小鼠IgG1），PE标记的鼠抗人MHCⅡ（HLA-DR）类分子（同型对照为PE标记小鼠IgG2a）各5 μl，室温避光反应30 min，PBS洗3次，最终定容于500 μl，流式细胞仪检测。
1.2.4 细胞因子的检测按照 ELISA试剂盒说明检测细胞培养液上清的IFN-γ、TNF-α水平。以加0.9%氯化钠溶液的细胞悬液为对照组。
1.3 统计学分析
全部统计采用SPSS 11.5软件进行，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 单核巨噬细胞鉴定
收集对照组和处理组的细胞悬液，用流式细胞仪检测其表面单核巨噬细胞特异性标志CD14，经分析CD14阳性细胞占90%，证实单核巨噬细胞培养成功。见图1。
2.2 抗原提呈相关分子MHCⅡ、CD80表达改变
应用流式细胞仪检测单核巨噬细胞表面与抗原呈递相关分子MHCⅡ类分子及CD80分子，结果显示，与对照组相比，林可霉素处理组的CD80、MHCⅡ表达明显降低（P＜0.05）。见图2、3。
2.3 单核巨噬细胞分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α检测
经过48 h作用后，林可霉素处理组的单核巨噬细胞分泌IFN-γ、TNF-α水平均显著降低（P＜0.05）。见图4。
2.4 单核巨噬细胞表面凋亡受体Fas表达检测
通过对流式细胞术检测单核巨噬细胞表面Fas受体的表达发现，林可霉素处理组表面凋亡受体表达显著升高（P＜0.01）。见图5。
3 讨论
林可霉素是临床抗感染常用药品，具有广谱抗革兰阳性菌的作用，然而，林可霉素应用过程中出现了明显的免疫功能抑制现象，明显限制了机体对外来病原微生物的产生的自身免疫应答。本研究通过对重要的免疫细胞树突状细胞的研究，从免疫应答的起始阶段来讨论林可霉素的作用。
单核巨噬细胞是体内重要的免疫细胞，它不仅是天然免疫系统的重要细胞，发挥着病原微生物入侵机体后前期直接杀灭病原微生物的作用，而且还可通过抗原提呈作用，激活后续病原微生物特异性T 淋巴细胞，导致机体产生针对病原微生物的特异性免疫应答，协助机体免疫系统清除病原微生物。
在本研究中发现，单核巨噬细胞表面分子MHC-Ⅱ类分子、CD80分子明显降低。MHC-Ⅱ类分子是T细胞活化的第一信号关键分子，CD80分子是单核巨噬细胞表面共刺激分子，两者共同为单核巨噬细胞激活特异性T细胞发挥重要作用[3-4]。林可霉素作用后，单核巨噬细胞表面MHC-Ⅱ类分子、CD80分子表达明显降低，证实其诱导特异性T细胞活化的能力显著减弱。
作为免疫细胞，单核巨噬细胞除了直接激活病原微生物特异T细胞外，还可分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α，促进特异性T细胞的活化、增殖及最终的杀伤作用[5]。经过林可霉素作用后，单核巨噬细胞分泌IFN-γ及TNF-α的作用明显减弱，从而导致杀伤性T淋巴细胞对病原微生物的清除能力明显减弱。
另外，Fas是一种能诱导细胞死亡的细胞膜死亡信号受体，与其配体（FasL）结合后会向细胞内传递死亡信号，导致细胞在短时间内发生死亡[6]。目前研究发现，在肿瘤、感染及其他因素的影响下，单核巨噬细胞可诱导性地表达Fas，与机体中的FasL结合，导致单核巨噬细胞死亡。在本研究中，林可霉素诱导了单核巨噬细胞高表达Fas，使单核巨噬细胞更易于凋亡，从而抑制了机体的免疫功能。
综上所述，本研究以单核巨噬细胞为切入点，证实林可霉素可以明显地抑制单核巨噬细胞免疫功能，并诱导其发生凋亡，从而有利于进一步指导临床用药。
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（收稿日期：2010-12-24）
