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文章编号：1005-619X（2007）06-0383-03 1 坏死和凋亡 坏死和凋亡是细胞死亡的两种形式，1972年Kerr等人详尽描述了凋亡。细胞凋亡是一种积极的生理过程，清除不需要的某些细胞，在生理和病理情况下调节细胞的数量。细胞凋亡一方面维持了正常细胞代谢，另一方面却破坏了人体正常的生理功能，如正常的组织细胞发育或修复等。
细胞凋亡具有形态学和生物化学方面的特征。凋亡的细胞表面皱缩，胞质致密，核染色质边集，胞核裂解，胞质芽突并脱落，形成含核碎片或细胞器成分的膜包被凋亡小体。被巨噬细胞和相邻其他实质细胞吞噬降解，不伴有周围组织的炎性反应。凋亡是耗能的主动过程，有新蛋白合成。DNA早期规律降解为180～200bp片段，琼脂凝胶电泳呈特征性梯带状。
坏死表现为细胞肿胀，细胞器崩解和蛋白质变性。细胞核固缩、裂解成碎片或溶解消失。
2 脑缺血后神经元细胞的凋亡
目前实验发现，脑缺血的急性期，细胞坏死与细胞凋亡并存，细胞坏死位于缺血中心区，而细胞凋亡主要出现在缺血半暗带；而在脑缺血的迟发性神经元死亡期，则以细胞凋亡为主。研究认为神经元细胞凋亡在缺血再灌注后24到72小时达到高峰，7天后消失。坏死和凋亡是相互联系的过程，一个细胞被启动了凋亡程序，但在此过程中如果ATP耗尽它也会发生坏死的形态学变化。这也许是在缺血性细胞凋亡中观察到的细胞凋亡程度差异性的原因。
3 细胞凋亡的有关机制
3.1 Caspase家族。
Caspase是一族凋亡蛋白酶，是IL-1β转换酶家族成员，是凋亡程序的主要执行者，到目前为止，已经发现了14种Caspase。Caspase在脑缺血损伤后以一种与血液凝固相似的“瀑布”方式被活化。Caspase-9是Caspase的启动者，负责活化下游的许多Caspase，被认为位于Caspase瀑布的顶端。效应Caspase，如Caspase-3完成细胞清除任务。Mouw[1]等研究发现Caspase-12是一种新的凋亡信号，定位于内浆网膜，他们在大鼠MCAO永久缺血模型研究中发现，24小时后 Caspase-12蛋白表达显著增加，Caspase-12mRNA水平上调，这种变化在纹状体比皮层更加明显。研究认为，胞浆中游离钙升高 引起 需钙蛋白酶活化并使其从胞质移位到内浆网膜，在内浆网膜活化Caspase-12。Caspase-12活化上游的Caspase-9，引起凋亡的瀑布级联反应。Caspase-12也可能在胞浆中通过内在与外在的凋亡途径，直接活化Caspase-3。内浆网的伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白(GRP78)，与Caspase-12结合、Caspase-17结合能阻止Caspase-12活化与释放。Caspase-12活化的另一种机制与肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)有关。
张拥波[2]等报道在鼠局灶性脑缺血模型中脑室内注射Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO可显著减少脑缺血后海马CA1区凋亡的细胞数，减少梗死面积，促进神经功能恢复，而Caspase-12抑制剂尚未见报道。
3.2 bc1-2家族。
bc1-2家族在细胞内凋亡信号传导中起重要作用。包括两组成员：抗凋亡成员和促凋亡成员。抗凋亡成员包括bc1-2、bc1-XL、bc1-X、bc1-l。促凋亡成员包括bax和bad、bak、bcl-XS、bik等。研究表明，Bc1-2与Bc1-XL的杂合二聚体可阻止细胞色素c(Cyt-c)释放，而当Bax接受死亡信号后，插入线粒体膜，形成Bax通道，促进Cyt-c释放。而Cyt-c进入胞质后，使bc1-2与Apaf-1（凋亡蛋白激活因子-1）分离，后者可激活凋亡执行者Caspase，从而使细胞凋亡。
Matsuoka[3]等报道应用腺病毒载体将bc1-XL基因和bFGF基因转染至培养的神经细胞，观察培养的神经细胞在谷氨酸兴奋毒性作用下的变化，发现神经细胞暴露于谷氨酸前及暴露后4小时bc1-XL和bFGF均有明显的神经保护作用，且二者联用比各自单独应用效果好。作者认为bFGF增加了bc1-XL的产生和新的合成。bFGF的保护作用依赖于GF的浓度。当10pg/ml时未观察到保护作用，而1ng/ml时存活细胞明显增加。
3.3 热休克蛋白。
热休克蛋白Hsp70[4]，1974年被首次报道，为一种潜在的细胞保护蛋白，属分子伴侣，分子伴侣在正常和应激情况下当蛋白质合成的时候辩认和促进正确的折叠，抑制蛋白质聚集，帮助变性的蛋白质再折叠。它们也协助监视和控制其他蛋白质与蛋白质的相互作用。Hsp70被证明抑制了多种类型的细胞死亡：包括坏死性死亡、典型的凋亡和其他不依赖Caspase和不能被bc1-2阻断的PCD途径。Hsp70对抗Apaf-1的作用抑制凋亡。也能与BAG-1（bc1-2结合蛋白）抗凋亡蛋白相互作用，阻断Caspase-3的活化，另外Hsp70还与C-jun，JNK相互作用调节其他的信号转导途径。在大鼠全脑或局部脑缺血中风模型实验中，缺血前12到15小时注射疱疹病毒载体诱导的Hsp70过量表达对神经元有保护作用，甚至在MCAO 1小时后的30分钟或2小时延迟注射Hsp70载体仍有保护作用，但缺血后5小时再用作用消失。载体注射后的4到6小时最早发现了蛋白表达的增加，12到24小时达高峰，这个重要性是不言而喻的，因为大多数中风病人在发作时不能及时在3小时内送达医院。
Hoehn[5]在大鼠MCAO模型（缺血1小时再灌注48小时）中用疱疹病毒载体将Hsp72基因注射到缺血纹状体，分别在缺血发作后半小时，2小时和5小时注射，纹状体神经元在2天后存活率上升23%和15%，延迟至5小时后Hsp72不再有保护作用。注射后4到6小时从HSV载体表达了Hsp72，这说明Hsp72治疗窗至少在缺血发作后的6小时。
4 其他有关治疗的研究进展
4.1 生长因子转移。
大多数神经元是依赖生长因子存活的，这些因子是小的肽类，分为神经营养因子、细胞分裂因子或生长因子。有些生长因子可作用于多种类型的细胞。生长因子同样也在细胞移动、收缩和分化中发挥作用。
“血管生成”作为一种治疗概念，在外周和心肌缺血的动物模型中已有过报道。缺血性中风促使血管生成激活，特别是在缺血半暗带。几种血管生长因子如FGF、HGF、和VEGF已经被用来治疗局部缺血动物模型。然而单纯的血管生成的刺激尚不足于治疗脑缺血，因此理想的生长因子应有两个功能：血管生成和神经营养功能。HGF作为一种胚胎运动神经元的存活因子，感觉神经和交感神经以及它们的前体对HGF也有反应，如增加分化、存活和轴突生长等。HGF在各种模型中也是一种潜在的血管生长因子。近来，HGF已成为神经保护物质研究的中心所在。
Shimamura[6]应用HVJ载体将人肝细胞生长因子注射到大鼠永久性大脑中动脉缺血模型的蛛网膜下腔。在大鼠脑脊液中监测到了人HGF蛋白，而且大鼠HGF浓度也增加了（几乎是非治疗组的10倍）。研究认为：用HGF基因转化预处理鼠MCAO模型，阻止缺血损伤与十分显著的细胞凋亡减少有关。过量表达的HGF减少了不正常的神经病学表现，伴随着显著的毛细血管密度增加。在活体转染HGF基因减少了血脑屏障的破坏，脑水肿没有恶化（与VEGF基因转染后不同）。作者认为HGF神经保护作用的机制是通过MAP和磷酯酰丝氨酸激酶/Akt途径抑制凋亡，另一种减少梗塞面积的机制，可能是发展了侧枝循环。
4.2 人骨髓干细胞转移。
Li[7]在大鼠永久性MCAO后静脉注射人骨髓干细胞(hMSC)后1天治疗组与对照组比较，神经功能有明显提高，凋亡细胞数明显减少。尽管多潜能的hMSC表达了脑实质细胞的蛋白表型，尚没有证据说明这些细胞真的分化替代了受损脑组织。最可能的机制是MSC直接参与缺血损伤神经元的可塑性的增强和刺激胶质细胞分泌神经营养物质。此实验作者用Sandwich ELISA法观察到了BDNF和NGF分泌水平显著增加。
MSC就像一个小分子工厂，产生一系列细胞因子和营养因子。hMSC选择性地进入脑缺血区和缺血脑组织相互作用，增加神经营养物质的分泌，减少缺血半暗带的神经元细胞凋亡，使血液供应相对完好的脑细胞增殖分化加快。有效地治疗中枢神经系统神经元损伤，也许要激活内在地代偿机制，包括脑循环的重建等。目前关于这方面的机制尚不清楚。
可以相信，MSC是一种有效治疗各种神经病学疾病的分子和细胞治疗法。
4.3 人脐血细胞静脉内注射。
Chen[8]在缺血2小时后再灌注Wistar大鼠模型研究中发现，在缺血后24小时，通过尾静脉注射3×106人脐血细胞，大鼠totarod test和 mNSS(Modified Nevrologicla severity Score)显示神经功能恢复明显好转，而缺血7天后注射HUCBC组仅仅mNSS显示神经功能恢复有提高。
作者发现注射HUCBC后14天和35天，在脑组织中发现了移植的HUCBC，而且缺血同侧半球比对侧更多。许多细胞进入缺血半暗带。HUCBC存活并且表达了特殊类型的细胞的标志物如GFAP、NeuN、MAP-2和FⅢ。体外培养细胞的试验数据显示HUCBC在24小时后显示出活性。
脐血是各种营养因子的来源，如造血克隆刺激因子1是中枢神经系统的生长因子。Thrombopoietin对造血细胞有增殖作用，可以抑制凋亡，正是这些营养因子促进了受损神经元的功能恢复，尽管在研究中作者发现了一小部分HUCBC表达了类似于神经元细胞的表型，但这似乎不是其作用的主要方面。
HUCBC为什么会选择性移植到缺血半暗区呢？有下面几种可能：一是血脑屏障的破坏。缺血3小时血脑屏障渗透性增加，48小时达到高峰，4天后开始下降，所以缺血24小时注射HUCBC比7天后注射效果好；二是缺血后的炎症反应分泌了一系列化学趋化因子，如单核细胞化学趋化蛋白-1(MCP-1/TE)、细胞粘附分子(ICAM-1)、血管粘附分子(VCAM)等；三是HUCBC表达了几种粘附相关抗原：整合素亚单位(α3α4) 和ICAM。这些细胞间的相互作用使HUCBC更易于透过血脑屏障。
HUCBC易于得到，并且已在临床广泛应用，静脉脐血细胞治疗是一种有效的早期中风治疗措施，而且它的治疗时间窗比r-tPA要长。
5 前景和问题
近来，随着细胞凋亡机制和抗凋亡治疗的研究进展，不断发现新的bcl-2和ICE和生长因子家族成员。凋亡的路径和信号转导系统也有新的发现。针对凋亡级联瀑布的各种抑制剂已有较多实验研究，有望用于临床卒中的治疗。有多种分化潜能的干细胞注射和各种抗凋亡因子的基因转移方法，更为凋亡的治疗提供了新的途径。但有关载体的安全性和保护作用的确切机制尚有待于进一步研究。
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