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汉坦病毒是引起肾综合征出血热（HFRS）的主要病毒,汉坦病毒的基因由 L、M、S 三个片段构成,分别编码病毒RNA聚合酶, 囊膜核蛋白G1和G2及核衣壳蛋白(简称核蛋白,Nucleocapsid Protein, NP)。血清学研究表明,汉坦病毒核蛋白具有很强的抗原性和免疫原性,同时NP抗原可以与汉坦病毒内的多种血清型病毒的免疫血清产生交叉反应,表明汉坦病毒的NP具有共同的抗原决定族。有鉴于此,我们对核蛋白的核心区域进行表达和纯化, 并用SDS-PAGE和Western-Blotting对重组核蛋白进行鉴定，为其应用于诊断抗原提供技术依据。
1材料与方法
1.1质粒与菌种
汉坦病毒76-118株由本室保存, 表达质粒pGEX-4T-1,菌株BL21从上海申友公司购买。
1.2单克隆抗体和血清
单克隆抗体由北京病毒所杭长寿教授和安徽医科大学倪大石教授惠赠；病人血清由上海市南汇区传染病医院提供。
1.3引物的设计与合成
上游：GAC CAG GAA TTC GCC CAT GAG GGT CAA TTA �G ；�下游： TCT GAA CTC GAG GAT GAT GCT CAG CCA GTC T。其PCR产物长度为334 bp,产物上游酶切位点为EcoRI;下游酶切位点为XhoI。
1.4模板制备
从HTNV 76-118株感染的Vero-E6细胞中提取总RNA作为模板。 用引物扩增出汉坦病毒S片段核心区域334 bp的片段,通过PCR反应获得目的片段,反应步骤如下：
每10 D引物溶于200 μL水中,模板取1μL溶于10 μL水中, 加样：模板 1 μL, 10X Buffer 5 μL, Mg�2Cl (25mM) 3 μL,4dNTP (10 mM)1 μL,Primer-UP 1 μL, Primer-Down1 μL, Taq (5 U/μL)0.5 μL, 加水至 50 μL。 反应条件：94℃ 2 min ；94℃ 30 s,65℃30 s,72℃ 40 s,35个循环；72℃5 min。
1.5重组质粒的构建
分别用限制性内切酶EcoRI, XhoI 酶切上述扩增片段和质粒pGEX-4T-1,以低熔点琼脂糖电泳回收目的片段,然后进行连接反应。用连接产物转化感受态宿主菌E.coli BL21,挑取转化菌,提取质粒,用酶切法和PCR扩增法鉴定重组质粒。
1.6.1将质粒(目的基因、空载体)转入BL21(DE3)菌株中取出冻存的BL21(200 μL/Tube)冰中溶解,取5 μL连接液加入菌液中，轻轻混匀,冰浴30 min,42℃ 1.5 min,冰浴 2 min,加入500 μL LB 37℃ 100 rpm45 min,取200 μL涂布至Amp板(100 μg/mL),37℃倒置培养过夜，至克隆长出; 扩增：取单克隆至�3 mL� Amp/LB中 37℃ 250 rpm 过夜；质粒抽提； 测序。
1.6.2少量表达取以下菌株在Amp培养基2XYT中摇菌过夜(目的基因、空载体、BL21空菌(无抗性))共4管,各取50 μL过夜菌加入5 mL 2XYT培养基中，其中目的基因接两管,37℃ 250 rpm3 h, 加入IPTG至终浓度0.5 mmol,37℃ 250 rpm4 h，诱导。留一管目的基因继续再诱导1 h,其余取出,每管取出100 μL菌液，离心后沉淀待用,目的基因(二管)，收集余下的�4.9� mL菌体，悬于500 μL PBS中，超声波裂解(12 s/次，共3次),高速离心后分别保留沉淀与上清。
1.6.3大量表达取少量甘油菌，在20 mL Amp/2XYT培养基中摇菌过夜。取出10 mL过夜菌转入1L培养基中，250 rpm 37℃ 摇2.5~3 h至OD600为0.4~0.6，加入IPTG至终浓度�0.5� mmol，继续摇菌3.5~4 h。 收集菌体，按1 g湿菌体/10mLBuffer A 悬浮细菌，合并成两管，超声10 min, 5 000 rpm�10 min�, 弃上清。沉淀用Buffer 20 mL悬浮（可用超声悬浮）保证充分悬浮，再超声10个10 s ,离心后弃上清。重复1次。沉淀用Buffer B悬浮，室温放置20 min，离心12 000 rpm ,15 min，重复2次。用Buffer C 20 mL 溶解沉淀过夜。15 000 rpm,15 min离心。取上清，对Buffer D 透析，每次大于8 h ,至少2次,再对 Buffer A 透析，每次大于8 h ,至少3次。
1.6.4表达产物的鉴定SDS-PAGE电泳分析及考马斯亮蓝染色，Western-blot进行表达产物的鉴定。
2结果
2.1SDS-PAGE蛋白电泳及考马斯亮蓝染色鉴定重组表达的蛋白
实验表明，该蛋白已表达，并存在于菌体的包涵体中，重组表达的蛋白为167aa，约12 000，GST的蛋白分子量为26 000，重
组的融合蛋白总分子量为38 000。在沉淀蛋白泳带相对分子质量38 000的位置，明显可见一条新生蛋白条带，与预计相对分子质量相符，可初步确定其为插入基因的表达产物(图1)。
2.2用Western Blotting 检测重组蛋白
将重组汉坦病毒蛋白分别与HFRS单克隆抗体及HFRS患者血清进行免疫印迹法反应，结果表明,重组汉坦病毒蛋白能与HFRS单克隆抗体及HFRS患者血清特异性结合（图2）。
3讨论
肾综合征出血热应采用早发现、早诊断、早治疗的治疗方案，患者血清中抗核蛋白抗体出现早。汉坦病毒的S基因在汉坦病毒中高度保守,是体液免疫的主要识别抗原,能刺激机体产生大量的抗体,同时参与细胞介导的保护性免疫,其编码产物核衣壳蛋白（NP）是HFRS诊断的理想抗原［1］。
本研究对S基因的部分片段进行了融合表达，克服了用感染的鼠肺或组织培养物制备的天然抗原需严格的防护条件，产量有限，稳定性欠佳等多种不利因素［2］。近几年来已有较多研制重组抗原的报道。本研究采用了汉坦病毒S基因N端部分基因（12KD）表达产物，而未用全长S基因是由于S基因表达产物为线性抗原，其抗原决定族主要集中于N端，而26KD抗原分子量小，表达量相对高，更适于抗原的制备［3］。我们把N端部分S基因克隆于pGEX-4T-1的EcoRI,XhoI酶切位点,与GST进行融合表达,融合蛋白质(GST-NP)的分子量为38KD。菌体的SDS-PAGE电泳表明融合蛋白GST-NP为不可溶性表达,即以包涵体的形式存在,Western-blotting染色表明表达产物有抗原性。实验表明，选用GST表达系统的特点是利用融合蛋白谷胱甘肽转硫酶既可提高表达和外源蛋白的可溶性，也可提供相对简易的检测和纯化方法［4］。
HFRSV抗体的检测已有数种成熟的方法,但抗原的检测尚无令人满意的方法,其主要问题是敏感性和特异性有待提高［5］。本研究中所采用的S基因片段为核心区域, 该片段足以产生流行于我国的两型汉坦病毒间的交叉免疫反应［6］。实验结果显示，筛选表达的重组抗原具有特异性，进一步证实了该片段可以用于检测全血中的HFRS特异性抗体。在今后的研究中,我们将考虑使用较长的基因片段或采用分段表达的方式,将表达的抗原合并使用,这种方法是否适合于汉坦病毒抗原的制备,将在今后做更深入的研究。
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