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【摘要】 本研究的目的是利用气道炎症小鼠模型来探讨中药有效成分Vam3调节气管炎症的免疫平衡的效果。小鼠用伴清蛋白腹膜内致敏，然后气管内发敏。在首次发敏后24 h用中药有效成分Vam3进行治疗。用地塞米松治疗组、生理盐水组及不作处理的空白对照组作为对照。中药有效成分Vam3的评价主要是对抗原特异性抗体的产生及产生细胞因子类型的影响。结果显示，与盐水对照组相比，中药有效成分Vam3可有效减少抗原特异性IgE、IL-4、IL-5和IL-13的水平，而IgG2和IFN-γ合成不受抑制。证实其有抗气道炎症和调节TH1/TH2 应答类型的作用，可用于气道炎症的治疗。
【关键词】 中药有效成分Vam3;气道炎症小鼠模型; TH1/TH2
The effect of active principle Vam3 switch TH1/TH2 balance in inflammatory airway murine model YU Nong,WANG Jian-ying,LIU Hong,et al.Asthma Hospital of Weifang,Weifang 261041,China
【Abstract】 The goal of this study was to investigate the effects of the Chinese herbal medicine active principle Vam3, derived from TCMs used to treat airway inflammation, on a well-characterized mouse model of inflammatory airway., view the effects of immunity balance in inflammatory airway modal. Mice sensitized intraperi toneally and challenged intratracheally with conalbumin were treated with Vam3 24 hours after the first intratracheal challenge. Dexamethasone-treated, saline solution sham-treated, and na�ve mice served as controls. The effects of Vam3 on inflammation, antigen-specific antibody production and cytokine profiles were evaluated. Vam3 treatment showed that it can decreased antigen-specific IgE, IL-4,IL-5,and IL-13 levels without suppressing IgE2a and IFN-γ synthesis. Approve that Vam3 can decrease airway inflammation and tune up TH1/TH2 immunity balance, clue to it can treats airway inflammation.
【Key words】 Chinese herbal medicine active principle Vam3;inflammatory airway munine model;TH1/TH2
呼吸道非特异性炎症是世界范围内的公共卫生问题，在过去的二十年中，COPD、哮喘等非特异性炎症性疾病的发病率和死亡率有所提高，尤其是在西方国家［1，2］。在呼吸道非特异性炎症患者和动物模型中，抗原诱导机体产生IgE、气道炎症已得到广泛研究。越来越多的证据提示，活化CD4+T细胞产生的TH2型细胞因子IL-4、IL-5和IL-13在呼吸道非特异性炎症的发病机制中具有重要作用［3,4］。
随着对呼吸道非特异性炎症机制认识的提高，抗炎已成为治疗哮喘的重要手段。皮质类固醇是最重要的抗炎药物，并且可以切实改善呼吸道非特异性炎症患者的肺功能。由于全身应用皮质类固醇可以产生许多毒副作用，因而吸入皮质类固醇治疗哮喘已成为首选方法。这种方法对于大多数患者可以减轻炎症和支气管狭窄［5］。多数报道认为这种吸入方法仅引起局部毒副作用，但也有人认为可引起全身副反应。这种治疗可引起肾上腺功能抑制，骨代谢降低，特别是在儿童可引起生长迟缓，儿童的发病率也在提高［6，7］。因而需要寻找新的方法来控制这种疾病，可以成为治疗疾病的替代性方法［8］。传统中医药在中国、日本和其他亚洲国家已应用了许多世纪。中药治疗COPD、哮喘的西医医学机制尚不清楚，因而需要更多的研究来探讨中药和有效成分的效应和作用机制。
Vam3是从山葡萄根（Vitis Amurensis Rupr.）提取的二苯乙烯低聚体类化合物［9］。山葡萄主要生长在中国的中部和东北地区，在民间用其根和茎治疗炎症性疾病。我们以往研究发现，从山葡萄根提取的Vam系列化合物，如Vam3、Vam4和Vain21等均具有相似结构和抗炎作用。本实验用小鼠动物模型来评价中药有效成分Vam3对免疫应答的影响。我们发现，中药有效成分Vam3可以调节TH1/TH2 应答，有效控制与哮喘相关的细胞因子，与地塞米松抑制TH1/TH2应答不同的是，中药有效成分Vam3主要抑制TH2应答，不影响IgG2a和IFN-γ合成。
1 资料与方法
1.1 小鼠和药物 雄性balb/c小鼠（6周龄）购自潍坊医学院实验动物中心［5］，伴清蛋白（CA）、刀豆素A（ConA）、地塞米松和二硝基苯（DNP）结合的清蛋白购自Sigma公司。ELISA用抗体购自Binding Site 和PharMingen。抗DNP IgE、IgG2a、IgGI购自Accurate Scientific。
1.2 中药有效成分Vam3的制备 中药有效成分Vam3由中国医学科学院药物研究所制备［10］。根据人和动物的体表面积来计算动物用药量，20 g小鼠折人体的1/387［11］， AKR小鼠按30 g计算。本实验中每只小鼠每次给药1 ml，2次/d。
1.3 抗原致敏、发敏及治疗 将200 μg的CA和2 mg的清蛋白溶解在0.3 ml的PBS中，给小鼠腹膜内注射，共两次，间隔一周，如图1所示。第二次致敏7 d后，将小鼠麻醉，用含100 ug CA的0.05 mlPBS气管内用药来发敏，在20 d和30 d时用2倍剂量进行发敏试验，方法同前［12］。初次发敏24 h后，胃内给以中药有效成分Vam31 ml进行治疗，2次/d，连续17 d（见图1）。用25型计量钝不锈钢针进行胃内给药。地塞米松治疗组腹膜内注射0.5 mg/（kg・d）地塞米松进行治疗。盐水对照组每天腹膜内给予盐水进行处理。未处理组同其他对照。
1.4 血清CA特异性抗体的测定 各实验组小鼠APTI测定结束后立即取血清并保存于-80℃。CA特异性IgE的测定用ELISA方法［13］。
为了测定CA特异性IgG2a和IgG1，用CA包被酶标板后进行封闭和洗涤。样品1∶50稀释后加入酶标板中4℃孵浴过夜。洗板后加入生物素化的大鼠抗小鼠IgG2a和IgG1的单抗，室温孵浴45 min。加入亲和素过氧化物酶（Sigma,1∶1000稀释），室温置15 min。洗板后，加入2,2′-azine-bis，室温置30 min，酶标仪405nm处读数。
由于没有商业化小鼠抗CA抗体，小鼠CA抗原特异性IgE、IgG2a、IgG1的浓度计算参照测定小鼠抗DNPIgE、IgG2a、IgG1时的标准曲线。简单的讲，DNP-清蛋白和CA以相同的浓度包被酶标板，4℃过夜、洗板并封闭。小鼠抗DNP IgE、IgG2a、IgG1抗体依次1∶2稀释10次，分别加入10个孔中。，起始浓度为1000ng/ml。其他步骤同上。所有实验均采用双孔，变异率>10%则重复实验以保证实验的精确性。
1.5 细胞培养和细胞因子定量 每组实验小鼠的脾细胞并悬于完全培养液中（RPMI1640中含10%的FBS,1%的青霉素和链霉素及1%的谷氨酰胺）。细胞在24孔培养板培养，每孔4×106/ml个细胞，培养液中含50 μg/ml的CA。细胞培养液中加入ConA（2 μg/ml）作为阳性对照并设阴性对照。培养72 h后收集上清。脾细胞培养上清中的IL-4IL-5IL-13和IFN-γ水平的测定用ELISA方法，操作参照说明书。
1.6 统计学方法 实验数据用SigmaStat 2.03统计软件进行处理。各治疗组之间的差异由ANOVA决定。
2 结果
2.1 中药有效成分Vam3对抗原特异性抗体应答的影响 为了确定中药有效成分Vam3治疗对体液免疫应答的影响，我们测定了血清CA特异性IgE和IgG2a的水平。如图2所示，中药有效成分Vam3治疗组的IgE水平的显著降低（PH2占优势的应答。然而与盐水处理组相比，中药有效成分Vam3组的IL-4分泌被完全阻断，而IL-5和IL-13的水平下降近40%。有趣的是，中药有效成分Vam3治疗组CA诱导的IFN-γ分泌量比盐水处理组升高约27%，且ConA诱导的IFN-γ水平与空白对照组相同。地塞米松治疗组则不同，无IL-4分泌，且IL-5和IL-13水平显著降低，但CA诱导的IFN-γ分泌被阻断，且ConA诱导的IFN-γ分泌比空白对照组显著降低。
图2 血清CA特异性抗体。（盐水组，n16; Vam3组，n11,地塞米松组，n12;空白对照组，n14）进行血清特异性抗体测定，用ELISA方法进行。A:IgE水平B：IgG2a水平。数据均数±SEM由每组4-6只小鼠数据进行计算。
图3 小鼠脾脏细胞培养上清中细胞因子的产生。细胞分离后分别用含有CA（50 μg/ml）、ConA（2 μg/ml）和不含其他成分的培养基进行培养。培养72 h后收集上清。通过ELISA方法测定上清液中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平。结果为重复实验的平均值。
3 讨论
患有变应性疾病的人或动物模型，当再次接触过敏原后，IgE可以通过使肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒来介导过敏反应［14～17］。相反IgG2a的产生则被认为对机体有利［18］。以前的研究表明，一些抗炎的传统中草药方剂，如小青龙汤，可以抑制实验动物的非特异性炎症，表明可能对该类疾病具有治疗作用［19］。Vam3是从山葡萄根（Vitis Amurensis Rupr.）提取的二苯乙烯低聚体类化合物。研究表明,中药有效成分Vam3治疗后来可以显著减少抗原特异性血清IgE的产生，IgG2a水平略有升高而IgG1水平下降。表明Vam3这种成分具有免疫调节作用，因而可能适于治疗COPD、哮喘等呼吸道非特异炎症性疾病。
正如Romagnani的综述中所讲［20］，TH2型细胞因子在哮喘的发病机制中具有重要作用。IL-4/IL-13促进B细胞类型转换产生IgE和粘液分泌增多，而IL-5对于嗜酸性粒细胞的富集、活化和生存起主要作用。本研究发现，与盐水处理组相比，Vam3下调了IL-4、IL-5和IL-13的水平。这些结果表明，中药有效成分Vam3抑制非特异性气道炎症与其下调TH2应答有关。中药有效成分Vam3可以抑制3种主要的TH2型细胞因子，因而可以提供比单用抗IL-4、IL-5和IL-13更全面的治疗方法。
在这个模型中，地塞米松也可以抑制气道炎症。然而与中药有效成分Vam3不同的是，地塞米松双向抑制了TH1（IFN-γ/IgG2a）和TH2（IL-4、IL-5、IL-13和IgE）应答。与盐水处理组比较，中药有效成分Vam3治疗组的IFN-γ水平较高，但并不高于空白对照组。这种免疫调节剂可能比用TH1型细胞因子（IFN-γ和IL-12）和TH1型佐剂更加具有优越性。因为它不会诱导产生比正常水平更高的TH1型细胞因子从而引起不必要的炎症［21-23］。这些发现表明，中药有效成分Vam3可能为临床提供优于糖皮质激素的治疗方法。
参 考 文 献
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