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[摘要]目的:探索阿卡波糖的发酵工艺,以提高阿卡波糖的发酵水平。方法:对阿卡波糖发酵培养基的考察,确定了阿卡波糖生物合成最佳的复合氮源比例,同时考察了发酵培养基中速效碳源、速效氮源、磷酸盐对阿卡波糖生物合成的影响,确定了其抑制作用浓度和最适作用浓度。结果:确定了最佳复合氮源比例组合为热榨黄豆饼粉/冷榨黄豆饼粉为1/2混合,得出葡萄糖最适浓度为2.5%,铵离子浓度为0.1%,磷酸盐浓度为0.2%。
[关键词]阿卡波糖;发酵工艺;发酵单位
[中图分类号]R944
[文献标识码]B
[文章编号]1006-1959(2009)12-0247-01
阿卡波糖是治疗Ⅱ型糖尿病的一线药物[1]。是从游放线菌(Actinoplanes sp.SE50)的发酵液中提取而来,控制病人在进食含有淀粉的食物后的血糖含量。对肠道内的一些消化酶都有强烈的抑制作用,有良好的药动学性质和低毒性。
1 实验材料
1.1 菌种阿卡波糖产生菌:游动放线菌Actioplanessp.AC-17
1.2 培养基:种子培养基(g/100ml):麦芽糖1.8、酵母粉0.5、热榨黄豆饼粉2.5、甘油0.2、轻质碳酸钙0.2,常水配置,调pH6.5发酵培养基(g/100ml):高麦芽糖8、葡萄糖2、热榨黄豆饼粉2、玉米浆0.2、谷氨酸0.1、磷酸二氢钾0.15、三氯化铁0.1、氯化钙0.3、碳酸钙0.4,常水配置,调pH7.0
2 摇瓶发酵条件
28℃摇床220r/min振摇培养28h后,30℃摇床220r/min振摇培养84h。
3 阿卡波糖发酵单位的测定
3.1 检测条件:岛津LC-10AT泵,SPD-10A紫外-可见光检测器,C-R6A积分仪;正向色谱柱HypersilNH2(250mm×4.6mm,5um);流动相:乙腈-磷酸盐缓冲液(0.01mol/L,pH值7.0)(65:35);流速�1.0ml/min;检测波长210nm。
3.2 方法:将发酵液4000r/min离心30min,取上清液1.0ml与�0.5ml蒸馏水和2.0ml乙腈混合后,11000r/min离心10min,取上清液以微孔滤膜过滤,取滤液20ul进样。精密称阿卡波糖标准品以二次蒸馏水配制成200mg/L标准品溶液作对照。
3.3 效价的计算:A=(W标×S样/S标)×样品稀释倍数,其中A:样品中阿卡波糖的效价(ug/ml)W标:标准品的效价(ug/ml)S标:标准品的峰面积S样:样品峰面积[2]。
4 结果与讨论
4.1 复合有机氮源对发酵的影响:见表1。考察发酵培养基中的有机氮源的组成。选取下列有机氮源物质组成不同的发酵培养基,看其对发酵产量的影响。
得出7号发酵培养基,阿卡波糖发酵单位明显高于其它种类的复合有机氮源。
4.2 速效碳源、速效氮源、磷酸盐对阿卡波糖生物合成的影响:分别改变葡萄糖、硫酸铵、磷酸盐的用量,来考察其对发酵培养基的影响,看其是否起抑制作用,确定其抑制最适作用浓度。
4.2.1 葡萄糖抑制浓度的考察:见表2。
从实验结果可以看出,加入少量的葡萄糖会促进阿卡波糖的合成,加入量过多则会对生物合成产生明显抑制作用。最适葡萄糖浓度为2.5%。
4.2.2 铵离子抑制浓度的考察:见表3。
结果表明,当硫酸铵浓度为0.1%时,发酵单位最高,为最适浓度。当铵离子浓度大于0.1%时,随着硫酸铵浓度的增加,阿卡波糖生物合成逐渐降低,对阿卡波糖的生物合成有较明显的抑制作用。
4.2.3 磷酸盐抑制浓度的考察:见表4。
