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[摘要] 目的 通过实时RT-PCR方法检测经定向诱导分化的表皮干细胞分子生物学特性，探讨干细胞疗法用于眼表重建的可行性。方法 实验组细胞以结膜上皮细胞为饲养细胞进行共培养，并设立空白对照组细胞培养相同时间，分别于第1、3、5、7天取各组细胞提取RNA进行实时RT-PCR定量检测β2-微球蛋白、角蛋白K13基因的表达水平。结果 实验组细胞共同培养3d后出现β2-微球蛋白、角蛋白K13基因的表达，第5、7天的表达量显著提高（P＜0.01）。结论 经本实验方法定向诱导分化后表皮干细胞可表达与正常结膜上皮细胞相类似的分子生物学特征。
[关键词] 皮肤干细胞；结膜上皮细胞；实时RT-PCR
[中图分类号] R329 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）27-10-03
Studies on Specifity Detection of Transdifferentiation of Epidermal Stem Cell to Conjunctival Epithelium
MENG Fanjian1CHEN Jiaqi2
1.Guangzhou Red Cross Hospital，Guangzhou 510220, China；2.Zhongshan Ophthalmic Center, SUN Yat-sen University, Guangzhou 510060，China
[Abstract] Objective To detect the transdifferentiation epidermal stem cells using realtime RT-PCR, and to ensure the feasibility of stem cell treatment on ocular reconstruction. Methods The experimental group cells were co-cultured with the conjunctival epithelial cells as the feeder cells with setting the blank control group. The both groups were cultured for the same time, and after 1, 3, 5, 7 day（s） extracted the RNA and detected the expression of genes beta-2-microglobulin and keratin 13 by real-time RT-PCR method. Results Since the third day there were expression of genes beta-2-microglobulin and keratin 13 in the experimental group, and on the fifth and seventh day the expression increased significantly（P＜0.01）. Conclusion The transdifferentiation epidermal stem cells in this study possessed the same biological characteristics as the normal conjunctival epithelium.
[Key words] Epidermal stem cell; Conjunctival epithelium; Real-time RT-PCR
表皮干细胞为皮肤组织中的专能干细胞，是一种成年组织干细胞[1]，可增殖分化为表皮中各种细胞成分，保持皮肤正常的表皮结构。表皮干细胞的分化方式有两种：对称分裂和不对称分裂。前者分裂成两个和母细胞相同的子代干细胞；而后者则分裂成一个子代干细胞和一个与母细胞不同的短暂扩增细胞（TAC）[2]，TAC属定向祖细胞。近年来干细胞疗法已成为治疗多种疾病的新途径，可替代、修复、加强受损的组织或器官的功能[3]。本研究应用组织工程学技术将表皮干细胞体外定向诱导分化为结膜上皮细胞，通过对目的细胞生物特性的检测，探讨其在临床眼表结膜重建治疗中的应用前景。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1人皮肤材料包皮标本来自中山大学第一附属医院泌尿外科包皮环切术患者，无泌尿系统疾病感染，患者年龄18～30岁，所取包皮标本均得到患者知情同意。
1.1.2结膜组织取自尸体眼正常结膜组织。
1.1.3试剂和仪器PCR用Taq酶采用TaKaRa公司的Ex-Taq；荧光定量试剂盒：SYBR（R） premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）购自TaKaRa公司（美国）；TRIZOL® Reagent RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司（美国）；RNA提取反转录PCR试剂盒购自Promega公司（美国）；RoboCycler®Gradient Temperature Cycler PCR仪（Stratagene公司，美国）；MJ Research OpticonTM4荧光定量PCR仪（美国）。
1.2方法
1.2.1饲养细胞的培养取尸体眼结膜，用加有1×103U/mL青霉素不含钙镁的PBS缓冲液冲洗3遍，于无菌超净台剪除结膜下筋膜组织，将其上皮面向上平铺于无菌培养皿中，加0.25% Dispase Ⅱ，置于37℃消化2h，弃去消化液并用无菌虹膜恢复器刮取上皮组织，并加入0.25%胰酶及0.02% EDTA消化约20min，待倒置显微镜下见到上皮细胞充分消化为多个单细胞状态时加入上皮细胞培养液中止消化，收集细胞悬浮液，置于离心管内，以1500r/min离心5min，获得消化的结膜上皮细胞，将其调整为1×104个/mL，在6孔Transwell培养板insert池中加入1mL结膜上皮细胞悬液饲养细胞组为实验组，对照组insert池中无饲养细胞，仅为相同体积的上皮细胞培养液。
1.2.2表皮干细胞的分离、筛选、培养取无菌手术获得的包皮皮片，用加有1×103U/mL青霉素不含钙镁的PBS缓冲液冲洗3遍后用含有1×103U/mL青霉素、2.5mg/L两性霉素不含钙镁的PBS缓冲液浸泡30min，无菌超净台剪除皮下组织，并剪成2mm×4mm皮条，浸泡于0.25% Dispase Ⅱ，置于4℃过夜。次日用眼科镊撕取表皮皮片，D-Hank’s液冲洗3次，并用眼科显微剪将其剪成1mm×1mm碎片，加入0.25%胰酶，37℃消化5～10min，用滴管吹打使细胞脱落，加入上皮细胞培养液中止消化，200目细胞筛过滤得细胞悬液，收集细胞悬浮液置于离心管内，以1500r/min离心5min，获得消化所得的皮肤上皮细胞。将其以1×106个/mL密度接种于Ⅳ型胶原（100μg/mL）铺底的培养瓶置于5% CO2、37℃细胞培养箱中待细胞贴壁20min后，去除未贴壁细胞，加入新的上皮细胞培养液，5% CO2、37℃细胞培养箱培养，1～2d换液一次。
1.2.3表皮干细胞与结膜上皮细胞共培养的诱导分化取1～2代表皮干细胞作为实验细胞，以5×106个/mL接种于6孔Transwell培养板中，实验组insert池中加入1mL结膜上皮细胞（细胞浓度为1×104个/mL）作为饲养细胞；对照组insert池中仅为相同体积的上皮细胞培养液，5% CO2、37℃细胞培养箱培养1、3、5、7d后，弃细胞培养液，分别取对照组和实验组细胞提取RNA，进行实时定量RT-PCR检测目的基因β2-微球蛋白、角蛋白K13的表达情况。
1.2.4细胞总RNA的提取吸出6孔Transwell培养板中的培养液，每孔加入1mL TRIZOL® Reagent，振荡混匀，15～30℃温育5min，每1mL Trizol加入0.2mL氯仿，振荡15s，然后于15～30℃放置2～3min，于2～8℃离心样品15min（＜12 000g），将上层水相移至新管中，每1mL原始Trizol用量加入0.5mL异丙醇，室温放置10min，4℃离心（＜12 000g），弃上清，每1mL Trizol用量用1mL 75%乙醇洗涤，振荡样品，然后7 500g离心样品5min（如果用来富集小分子RNA，则不用75%乙醇洗涤，直接进入下一步），空气干燥RNA 10min，用适量RNase free水溶解，于60℃温育10min，置于-80℃备用。
1.2.5引物的构建按照参考文献[4]构建设计：β-actin正向引物：5’-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3’，β-actin反向引物：5’-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3’；β2M正向引物：5’-GAATTGCTATGTGTCTGGGT-3’，β2M反向引物：5’-CATCTTCAAACCTCCATGATG-3’；CK13正向引物：5’-GAGGAATGGTTCCACGCCAAG-3’，CK13反向引物：5’-GCGACCAGAGGCATTAGAGGT-3’。
1.2.6PCR扩增取3μL逆转录反应产物做模板，根据试验目的加入相应的正向引物和反向引物。PCR反应总体系为20μL。条件为95℃ 5min，1个循环；94℃ 30s，57℃ 40s，72℃ 40s，共30个循环；72℃ 10min，1个循环。
1.2.7荧光定量PCR按照SYBR（R）Premix Ex TaqTM试剂盒的说明书进行。取1μL逆转录反应产物做模板，20μL反应体系，引物浓度为10nM/μL，各加入0.5μL。SYBR（R）Premix Ex TaqTM 10μL，用双蒸水补平至20μL。反应程序为94℃ 10s，1个循环；94℃ 5s，58℃ 31s，读板，40个循环。数据分析采用2-△△CT方法。
2结果
Realtime RT-PCR的结果见图1、图2。结果可见实验组表皮干细胞5d及7d后β2-微球蛋白mRNA的表达明显上调，分别为（300±26）%（P＜0.01）、（300±13）%（P＜0.01）；CK13 mRNA表达上调（480±110）%（P＜0.01）、（760±53）%（P＜0.01）。与对照组相比，β2-微球蛋白mRNA及CK13 mRNA表达都有显著性上调。
图1表皮干细胞中β2-微球蛋白mRNA的表达水平5d实验组细胞中β2-微球蛋白mRNA表达上调（300±26）%（P＜0.01）；7d实验组细胞中β2-微球蛋白mRNA表达上调（300±13）%（P＜0.01），其中n=5，6
图2表皮干细胞中CK13 mRNA的表达水平5d实验组细胞中CK13 mRNA表达上调（480±110）%（P＜0.01）；7d实验组细胞中CK13 mRNA表达上调（760±53）%（P＜0.01），其中n=5，6
3讨论
角蛋白（keratin）是上皮细胞中特异性的中间丝成分。已知的细胞中表达的各种角蛋白家族亚单位成员具有组织特异性，并且和细胞的分化相关[5]。例如：Krenzer等[6]报道：在正常结膜上皮细胞中表达角蛋白K13/K4/K8/K19/K7。Dota等[7]研究报道：通过对38例正常结膜组织的上皮细胞建立的cDNA文库，检测出角蛋白K13是结膜细胞转录中表达最丰富的基因，且该基因与细胞骨架的合成有关，并认为K13有可能是有关眼表结膜细胞分化最敏感的基因。而且早期的研究中也证明：在结膜上皮细胞的免疫组化鉴定中结膜上皮细胞可被特异性角蛋白K13抗体标记，而在皮肤干细胞中并无相应抗体的表达[8]。
β2-微球蛋白（beta-2-microglobulin）是HLA抗原的成分之一。虽然有关该种蛋白的功能尚未明确，但是该蛋白存在于泪液中并可能来源于结膜上皮细胞中。并且在正常状态下泪液中的β2-微球蛋白浓度明显高于炎症时泪液中浓度。Dota等[7]研究中也同时检测到β2-微球蛋白也是结膜上皮细胞转录较高的基因，因此本研究将CK13和β2-微球蛋白作为结膜上皮细胞标记性（特异性）的高效表达基因。
近年来，相关文献[9-11]报告了通过组织工程技术将成体干细胞体外合成生物替代品，并对其组织功能改良用于眼表重建的临床治疗新技术。然而，成功的眼表重建依赖于两个重要因素。其一，具有高分化、高增殖能力的干细胞；其二，干细胞的载体组织。本研究中应用具有高分化、高增殖能力的表皮干细胞为种子细胞，从而保证眼表重建治疗中能获得可靠的细胞源。我们早期的相关研究中[4]报告应用同源异体的结膜去细胞基质膜为干细胞载体膜，不仅可保证具有良好的组织相容性，而且也确保在体外模拟形成结膜上皮细胞增殖的组织微环境。从而诱导表皮干细胞定向分化、增殖。
研究结果显示经诱导分化的表皮干细胞在短时间内具有结膜上皮细胞的特异性基因CK13及β2-微球蛋白的高表达，提示该实验方法可诱导表皮干细胞形成特异性短暂扩增细胞（TAC），并能定向分化为类结膜上皮细胞。因此，在临床上眼表重建的干细胞疗法应用中，该方法不仅可保证获得充足的目的细胞来源，而且确保目的细胞具有稳定的生物学特性。在眼表结膜组织的重建及生理功能恢复的临床治疗中提供有效的组织来源。但是，该研究方法中诱导分化的表皮干细胞作为种子细胞能否合成人工结膜生物膜活体动物眼表的存活状况及生理功能重塑方面的问题，还需要进一步的研究探索。
[参考文献]
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（收稿日期：2011-08-19）
