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[摘要] 目的 探讨血管内皮细胞生长因子-C与血管内皮生长因子受体-3在直肠癌中的表达及意义。方法 检测50例直肠癌患者的直肠远端切缘组织中的VEGF-C、VEGFR-3蛋白表达，并取50例正常直肠组织作对照。结果 直肠癌患者的癌组织中VEGF-C、VEGFR-3的表达要远高于正常对照组（P＜0.05），VEGF-C、VEGFR-3的表达与性别、分化程度、浸润深度无关（P＞0.05）；而与淋巴结转移、Dukes分期有关（P＜0.05）,且VEGF-C、VEGFR-3在直肠癌组织中的表达呈正相关。结论 VEGF-C、VEGFR-3在直肠癌组织中均呈高表达，二者的表达可能与直肠癌淋巴转移过程有关。
[关键词] 内皮细胞生长因子-C；血管内皮生长因子受体-3；直肠癌
[中图分类号]R735.3+7[文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2011）27-22-03
Expression and Its Clinical Significance of Vascular Endothelial Growth Factor-C and Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 in Rectal Cancer Tissue
WU WenhuiTANG YouzhenYANG ShibinXIAO Longbin
Department of Gastrointestinal Surgery, Huangpu Hospital of the First Affiliated Hospital, SUN Yatsen University, Guangzhou 510700, China
[Abstract] ObjectiveTo detect expression of vascular endothelial cell growth factor-C and vascular endothelial growth factor recipient-3 in rectal cancer tissue, and evaluate its clinical significance. Methods VEGF-C, VEGFR-3 protein express in distal margin tissue of tumor from fifty rectal cancer patients were detected, and were compared with 50 normal rectal tissues. Results The express of VEGF-C,VEGFR-3 in rectal cancer patients’ tissue was much higher than that in normal rectal tissues（P＜0.05），the express of VEGF-C、VEGFR-3 has no relationship with gender, differentiation level, depth of infiltration（P＞0.05）, but related to lymph node metastasis, Dukes staging（P＜0.05）,expression of VEGF-C、VEGFR-3 in rectal cancer tissue showed positive correlation. Conclusion VEGF-C、VEGFR-3 in rectal cancer tissue shows high expression, and this might be linked to process of lymph node metastasis.
[Key words] Vascular endothelial cell growth factor-C；Vascular endothelial growth factor recipient-3；Rectal cancer
直肠癌（rectal cancer）是胃肠道中最常见的恶性肿瘤，其发病率仅次于胃癌和食道癌。直肠癌常易发生转移，这也是其致死的主要原因，其主要转移途径为淋巴转移。近年来有报道称[1]，血管内皮细胞生长因子-C（VEGF-C）与血管内皮生长因子受体-3（VEGFR-3）可能在肿瘤的淋巴转移过程中起关键作用。为探讨它们与直肠癌淋巴转移的关系，本文特选择50例直肠癌患者石蜡标本，采用免疫组化法观察其远端组织中血管内皮细胞生长因子-C与血管内皮生长因子受体-3的表达，报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
收集我院病理科于2009年1月～2010年12月保存的直肠癌石蜡标本50例（标本均取自直肠远端切缘组织）。其中男30例，女20例；年龄27～81岁，平均年龄(58.15±9.34)岁。所有患者直肠癌的病理类型均为腺癌，高分化者15例、中分化者22例、低分化者l3例；肿瘤直径范围为1.5～6.8 cm；肿瘤浸润的深度为：浸润至肌层17例、浸润至浆膜层19例、浸润至浆膜下层14例；存在淋巴结转移者26例，无淋巴节转移者24例；；Dukes分期：A+B期20例，C+D期30例。患者行病灶切除前均未进行放疗或化疗治疗，且手术类型均为全直肠系膜切除，患者的临床资料及病理资料均完整保存。为进行实验对比，另选择50例正常者直肠远端组织作为对照组。
1.2试剂与方法
（1）术中取组织后进行HE染色，常规HE染色后用光学显微镜观察组织的病理学形态。
（2）免疫组化法[2]：试剂：兔抗人VEGF-C多克隆抗体、兔抗人VEGFR-3多克隆抗体（北京中杉金桥公司）。免疫组化过程：①将石蜡切片放入二甲苯溶液中脱蜡、去离子化；再放入乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液中进行抗原高压热修复；将处理后的切片放在实验室中自然冷却。②加入打孔剂室温下洗涤10min；标本放入3％过氧化氢溶液10min，用于封闭内源性过氧化物酶，后用PBS缓冲液洗涤标本3次，每次3min.③向标本中滴入特异性兔抗人VEGF-C多克隆抗体、兔抗人VEGFR-3多克隆抗体，放入浓度5%的CO2培养箱孵育过夜。④第2天取出标本，再用PBS缓冲液洗涤3次，每次3min。⑤向标本中加入PV9000试剂盒中的大分子通透剂，于CO2培养箱37℃孵育30min ；取出后再用PBS缓冲液洗涤3次，随后加入试剂盒中抗兔抗体酶复合物，于CO2培养箱37℃孵育30min；取出后再用PBS缓冲液洗涤3次。⑥用二氨基联苯胺（DAB）控制标本的显色，流水冲洗3h，苏木素染色，封片，放在光学显微镜下观察。PBS代替一抗做阴性对照。
1.3结果判定
VEGF-C、VEGFR-3的表达均定位于细胞浆及细胞间质，阳性为胞浆中染色出现黄色颗粒。采用半定量积分法：细胞计数取高倍镜（×400）下取5个视野，计数阳性肿瘤细胞数目并计算其占肿瘤细胞数的百分比。0分：其比率＜5％；1分：比率5％～25％；2分：26％～50％；3分：51％～75％；4分：＞75％。染色强度评分：0分为无染色，1分为染色呈淡黄色，2分为黄或深黄色，3分为褐色。以上两项积分相乘＞4分才可判定为阳性。
1.4统计学处理
数据以SPSS13.0统计软件分析处理，计数资料采用行×列的χ2检验行组间比较，相关分析采用Spearman等级相关分析检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1VEGF-C、VEGFR-3在直肠癌患者与正常对照直肠远端组织中的表达
染色结果显示，VEGF-C主要表达于细胞浆中，VEGFR-3主要表达于细胞浆和细胞间质中。对照组直肠远端相应切缘组织中VEGF-C、VEGFR-3表达较弱，阳性率分别为25.1%和22.7%。而在直肠癌患者的远端直肠切缘组织中此二者的表达呈强阳性，阳性率分别为64.3%和61.4%，二者的阳性率比较差异均有统计学意义(χ2=11.23,9.76，P＜0.05）。
2.2 直肠癌组织中VEGF-C、VEGFR-3的表达与相关因素的关系
将50例直肠癌患者的标本按照性别、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、Dukes分期等进行分组，比较VEGF-C、VEGFR-3的表达。结果显示，VEGF-C、VEGFR-3的表达在性别、分化程度、浸润深度三个因素中差异无统计学意义（P＞0.05）；在淋巴结转移、Dukes分期两个因素中差异有统计学意义（P＜0.05）,具体数据见表1。
2.3VEGF-C、VEGFR-3二者表达的相关性
经Spearman等级相关分析，直肠癌组织中VEGF-C与VEGFR-3的表达呈正相关，结果有统计学意义（r=0.372，P ＜0.05）。见表2。
表2VEGF-C、VEGFR-3二者表达的相关性
VEGF-C VEGFR-3 rP
阳性 阴性
阳性 22 7
阴性 5 11 0.371 0.003
3讨论
在我国，近年来直肠癌的发病率有逐年上升的趋势，且患者逐渐年轻化。在直肠癌患者中，淋巴转移是导致患者预后不良和死亡的重要因素。由于直肠癌的发生、发展和转移都是相当复杂的过程，因此目前对其分子机制还不清楚。但近年来有研究表明，VEGF-C和VEGFR-3在促进肿瘤淋巴管生成及淋巴结转移过程中发挥了重要作用。本文即选择了此二者为研究对象，探讨其与肿瘤转移的关系。
在人类的基因组中，VEGF-C基因长约40kb，它能稳定的表达出一种高度保守性的蛋白，这种蛋白能够促进淋巴管、血管内皮细胞增生，从而参与人体多种病理生理过程[3]。VEGFR-3则是在胚胎早期即定位于血管内皮细胞，之后还会在淋巴管内皮细胞上表达。有研究表明，VEGF-C与VEGFR-3具有高度亲和力，二者共同作用可激活酪氨酸激酶生物信号传导系统，细胞有丝分裂增加可诱导肿瘤新生淋巴管形成[4]。本研究的结果显示，直肠癌组织中VEGF-C与VEGFR-3的表达呈正相关，这也支持了以上论点。本文的结果还显示，对照组直肠远端相应切缘组织中VEGF-C、VEGFR-3表达较弱，阳性率分别为25.1%和22.7%。而在直肠癌患者的远端直肠切缘组织中此二者的表达呈强阳性，阳性率分别为64.3%和61.4%，二者的阳性率比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。这提示，直肠癌患者的癌组织中VEGF-C、VEGFR-3的表达要远高于正常对照组，说明此二者的高度表达可能与肿瘤的生长和转移相关。
通过本文的实验我们还发现，VEGF-C、VEGFR-3的表达在性别、分化程度、浸润深度三个因素中差异无统计学意义（P＞0.05）；在淋巴结转移、Dukes分期两个因素中差异有统计学意义（P＜0.05）。这说明性别、分化程度和浸润深度可能不是影响淋巴结转移的影响因素，而VEGF-C、VEGFR-3的表达可能与淋巴结转移和Dukes分期有关。有报道也称[5，6]，肿瘤细胞自身也可分泌VEGF-C，以促进其外周和内部的淋巴管形成，淋巴管数目的增多使癌细胞更易于侵入淋巴管从而促进淋巴结转移。相当多的恶性肿瘤组织中均会高表达VEGF-C，因此考虑其可能与淋巴结转移相关。
综上所述，随着肿瘤淋巴管转移机制的深入研究，抗淋巴管生成治疗可成为治疗肿瘤转移的新亮点。He等已经在应用可溶性VEGFR-3受体蛋白抑制小鼠肺癌淋巴管生成方面取得了成功[7]。另外，我们还可以应用VEGF-C、VEGFR-3联合检测来初步估计患者的预后及为治疗方案的确定提供依据。
[参考文献]
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（收稿日期：2011-08-01）
