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[摘要] 目的 了解转化生长因子-β1（TGF-β1）和HBcAg在轻度慢性乙型肝炎患者肝组织中的表达情况。方法 采用免疫组化法（S-P）检测10例对照肝组织、90例轻度慢性乙型肝炎患者肝组织TGF-β1、HBcAg的表达。结果 90例轻度慢性乙型肝炎患者肝组织TGF-β1随肝脏纤维化加重而表达增加，其差异具有显著性（P＜0.05），正常肝组织组TGF-β1无表达；轻度慢性乙型肝炎患者肝组织HBcAg阳性率为81.11%，HBcAg是更可靠的HBV复制指标。 结论 TGF-β1、HBcAg的表达在轻度慢性乙型肝炎患者肝组织肝纤维化的形成和发展中起重要作用。TGF-β1、HBcAg的表达与早期临床诊断及治疗和判断预后密切相关。
[关键词] 轻度转氨酶升高；慢性乙型病毒性肝炎；转化生长因子-β1；乙肝核心抗原；免疫组织化学
[中图分类号] R512.6+2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2011）26-17-03
Expression and Clinical Significance of TGF-β1 and HBcAg in Chronic Hepatitis B Virus Carriers with Slight Unusual Liver Function
ZHUge lu JIN Lingxiang LIN Wei PAN Chenwei FANG Peipei ZHOU Guangyao
Infectious Department，the 2nd Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325000，China
[Abstract] Objective To detect the expression of transforming growth factorβ1（TGF-β1） and HBcAg in chronic hepatitis B virus carriers with slight unusual liver function. Methods All the livers were detected by immunohistochemistry（S-P）. Results With the increase of liver fibrosis and increased expression of TGF-β1， there was significant difference（P＜0.05）. There were no expression of TGF-β1 in normal liver tissues. The positive rate of HBcAg was 81.11% in the research group，it was more reliable copy index of HBV. Conclusion TGF-β1 and HBcAg may play an important role in the development of liver fibrosis，especially they are tightly correlated with clinical pathologic factors.
[Key words] Slight unusual liver function； Chronic hepatitis B； Transforming growth factor-β1（TGF-β1）；HBcAg；Immunohistochemistry
乙肝病毒复制是导致慢性乙肝患者疾病进展的根源，故目前针对慢性乙肝最基础的治疗是抗病毒治疗。慢性乙肝抗病毒治疗的一般适应证为ALT≥2ULN（正常上限值）且病毒复制活跃的患者。但近年研究表明，ALT和（或）AST＜2ULN甚至转氨酶正常的慢性HBV感染患者，同样可能存在肝组织的改变。由此在2010年版《慢性乙型肝炎防治指南》中针对乙肝抗病毒治疗适应证中，对患者基线ALT水平的标准进行了具体的更改，如对ALT＞ULN且年龄＞40岁者，也应考虑抗病毒治疗等[1]。本实验通过探讨ALT在1～2ULN的慢乙肝患者肝组织中的转化生长因子-β1（TGF-β1）和HBcAg的表达及其分布情况，以期为该类患者是否需进行抗病毒治疗提供早期依据。
1 材料与方法
1.1 材料
选取2007年1月～2010年5月温州医学院附属第二医院存档蜡块和外科切除肝组织标本，共90例。全部病例ALT和（或）AST 1～2倍ULN，半年内未使用过抗病毒及保肝治疗，一年内每三个月复查一次肝功能，排除肝穿刺的禁忌证。除外重叠其他嗜肝病毒感染、合并其他非嗜肝病毒感染、脂肪肝、酒精性肝病、淤胆型肝炎、药物性及自身免疫性肝病病例。上述病例的临床及病理均符合2000年9月中华医学会西安会议修订的《病毒性肝炎防治方案》标准[2]。其中男性62例，女性28例，年龄17～58岁，平均（31.5±14.3）岁。90例肝组织标本予10%甲醛固定，石蜡包埋。选择10例正常肝组织对照，为外科手术中获得。切片处理：蜡块切成4μm厚，连续切片4张，55℃烤箱内烤，常规和免疫组织化学染色。试剂：兔抗人TGF-β1 多克隆抗体、鼠抗人HBcAg多克隆抗体（购自福建迈新公司）。
1.2 免疫组织化学染色方法
采用S-P法（链霉菌抗生物蛋白-过氧化酶联接法）。
1.3 免疫组化结果判断
以PBS代一抗为阴性对照。细胞浆染色呈棕黄色为TGF-β1阳性细胞，用HPIAS 1000图文分析系统对TGF-β1图象进行定量分析，随机选取 10个视野，测定每一视野中TGF-β1的含量，以阳性表达区域占全视野面积的百分比表示，取平均值。HBcAg蛋白阳性表达呈棕黄色，主要定位于细胞浆。随机选择5个高倍镜视野进行阳性细胞计数，免疫组化染色阳性细胞分成4个等级：无棕黄染色为阴性；＜10个细胞为+；10～20细胞为++；＞20个细胞为+++。
1.4 统计学处理
用SPSS10.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，同一指标组间比较用方差分析SNK-q检验，两指标间相关性采用直线相关分析。
2 结果
2.1 肝组织病理结果
所有患者均有不同程度的肝组织受损，其中病理诊断为慢性乙型肝炎轻度59例，中度以上的为24例（慢性乙型肝炎中度11例，重度13例），有7例病理诊断为肝硬化。83 例病理诊断为慢性乙型肝炎的患者中，G≥2者27例（32.53%）， S≥2者25例（30.12%）。
2.2 轻度慢性乙型肝炎患者肝组织炎症分级及纤维化分期
剔除7例病理诊断为肝硬化的患者，余下的83例慢性乙型肝炎患者，其炎症分级呈G1～G3 分布；纤维化分期呈S0～S3分布。见表1。
2.3 轻度慢性乙型肝炎患者肝组织TGF-β1 免疫组化结果
正常对照肝组织组，TGF-β1未见表达。TGF-β1 染色阳性细胞为细胞浆呈棕黄色。S0期未见明显阳性表达；S1期阳性物质主要分布在肝窦、窦周细胞、坏死灶与汇管区，但着色不深；S2期分布部位与S1期相似，但染色稍有加深；S3期在纤维间隔、肝细胞中均有分布，且着色较前加深；S4期肝细胞内可见大量染色阳性物质。
2.4 轻度慢性乙型肝炎患者肝组织TGF-β1图像定量分析及其与肝纤维化的关系
见表2。
表2 轻度慢性乙型肝炎肝组织TGF-β1与肝脏纤维化分期的关系纤维化分期（S） 病例数 TGF-β1（10-2）
注：S0：S1～S4 q值分别为8.95、12.02，16.53，32.36；S1：S2～S4 q值分别为4.96、12.65，31.78；S2：S3～S4 q值分别为9.06、28.33；S3：S4 q值为18.51；P均＜0.05
2.5 HBcAG在轻度慢性乙型肝炎患者肝组织中的表达
90例患者肝组织中HBcAG表达强阳性者8例（8.89%），中等阳性表达者28例（31.11%），弱阳性表达者37例（41.11%），阴性表达者17例（18.89%）。而10例正常肝组织中未见阳性表达，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。
3 讨论
慢性乙肝最基础的治疗为抗病毒治疗。现公认的慢性乙肝抗病毒治疗的主要适应证为转氨酶≥2ULN且病毒载量高的患者。虽然，近年来国内外学者对ALT水平正常或＜2ULN的患者进行了大量的肝脏病理学研究，发现大多数该类患者存在不同程度的肝脏炎症反应和纤维化。2010年版《慢性乙型肝炎防治指南》对乙肝患者抗病毒治疗时的基线转氨酶水平的情况也做了更为具体的说明，但至今对ALT和（或）AST在1～2ULN的慢性乙肝患者是否需行抗病毒治疗仍未达成共识。
肝纤维化系由肝脏慢性损伤引起细胞外基质（ECM）过度沉积所致。转化生长因子β1（TGF-β1）通过对肝星状细胞（HSC）、肝实质细胞、肝窦内皮细胞等的直接作用以及对与纤维化有关的其他生长因子和各种酶类施加广泛影响，促进ECM合成并抑制其降解，是目前已知的最强的刺激形成肝纤维化因子，在肝纤维化的启动、进展中发挥关键性作用。在正常肝脏组织中，TGF-β1一般无或仅有极少存在。本试验中提示在肝纤维化状态下，肝组织的纤维间隔、肝窦内皮细胞、窦周细胞、肝细胞等为其较强的表达部位。TGF-β1可使 HSC转化为肌成纤维细胞，使胶原纤维分泌增多，促进 ECM合成，导致肝纤维化。活性的TGF-β1可以通过存在于细胞表面上的TGF-β1受体系统完成其信号转导，促进纤维化的发生发展。因此，如果能抑制TGF-β1的生成，则能阻断TGF-β1的信号转导，从而在根源上阻止肝纤维化的进展。以TGF-β1为靶向的抗纤维化研究正在得到关注[3]。
本实验观察了轻度慢性乙型肝炎患者肝组织中，肝纤维化在各个分期TGF-β1在肝组织内的表达及分布水平，结果提示S0期TGF-β1基本没有表达；S1期TGF-β1主要分布于窦周细胞、肝血窦壁；S2期的情况与S1期类似，但染色有所加深；S3期TGF-β1在纤维间隔、肝细胞内较多分布；S4期TGF-β1在纤维间隔、肝细胞内大量分布。与康海燕[4]等研究报道的TGF-β1与肝纤维化的关系相一致。实验结果表明，轻度慢性乙型肝炎患者肝组织TGF-β1随肝脏纤维化加重而表达增加。
细胞免疫和体液免疫在肝细胞受损的过程中起重要作用，在慢性乙肝的发病机制中，前者占主导地位。受乙肝病毒感染的肝细胞膜上HBcAg是T淋巴细胞攻击的靶抗原。HBcAg是组成乙肝病毒核壳的主要部分，是乙肝病毒在体内复制的重要指标。编码HBcAg的开放阅读框中含有2个起始密码子AUG，2个AUG间的区域为我们常提及的前C区，分别合成HBcAg/p21、HBeAg/p18。HBcAg/p21由第2 个起始密码子编码，HBeAg/p18由第1个起始密码子开始合成，若前C区基因发生突变，可表达HBcAg，但不能表达HBeAg[5]。说明HBcAg作为HBV复制和传染性指标比HBeAg更为可靠[6]。临床研究表明，血清 HBeAg、HBV-DNA与肝组织内的 HBcAg有一致性，都是 HBV复制的指标[7]。本研究中的肝组织中HBcAg阳性率为81.11%，阳性率较高，与入选患者的HBV-DNA载量较高有关（HBV-DNA 104～106者29例、 HBV-DNA 107～109者61例）。刘建芳等[8]报道血清 HBV-DNA与肝组织HBsAg、HBcAg呈正相关。肝组织内 HBcAg的存在是 HBV复制指标，HBcAg有很强的免疫原性，能引起宿主较强的免疫应答，导致疾病的进展。
TGF-β1在肝纤维化的启动、进展中发挥重要作用，TGF-β1的局部高浓度与肝纤维化密切相关。HBcAg是更可靠的HBV复制指标，乙肝病毒复制是疾病进展的根源。因此，检测TGF-β1、HBcAg的表达可对轻度慢性乙型肝炎病变从分子水平进行评估，有利于该类患者早期诊断及确定合理的临床治疗和预后的判断。
[参考文献]
[1] 中华医学会肝病学分会、中华医学会感染病学分会. 慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）[J]. 中国预防医学杂志，2011，12（1）：1-15.
[2] 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会. 病毒性肝炎防治方案[J]. 肝脏，2000，5：257-263.
[3] 叶伟东，陈永平，徐少杰，等. 肝纤维化大鼠肝脏 Bcl-2、Bax增殖细胞核抗原的表达及重组转化生长因子β1疫苗对其表达的影响 [J]. 中华传染病杂志，2007，25（7）：398-402.
[4] 康海燕，董江龙，王建彬，等. 260例乙肝患者肝组织转化生长因子β1与肝纤维化及肝功能的关系[J]. 临床肝胆病杂志，2009，25（1）：61-62.
[5] 张树林. 乙型肝炎血清学标志物临床意义的再认识[J]. 国外医学：流行病学与传染病学分册，1993，20（2）：57.
[6] Sagnelli E. Radioimmunoassay for hepatitisB core antigen[J]. Clin Chem，1982，25：351.
[7] 韦艾凌. 疲痛消胶囊抗肝纤维化的实验研究[J]. 辽宁中医杂志，2002，29（7）：446-447.
[8] 刘建芳，张玉喜，李又平，等. 慢性乙型肝炎患者肝组织中 HBsAg、HBcAg的表达与血清HBV-DNA含量的关系[J]. 宁夏医学杂志，2007，29（9）：782-783.
（收稿日期：2011-07-22）
