【www.zhangdahai.com--卫生防疫公文】
【摘要】研究氧化修饰低密度脂蛋白对内皮细胞中血管内皮生长因子表达的影响以及迷迭香酸的保护作用。在人脐静脉内皮细胞株HUVEC培养基中加入ox-LDL或ox-LDL+迷迭香酸,培养24h,用酶联免疫吸附试验检测各组内皮细胞培养上清液中VEGF蛋白含量;用原位杂交检测VEGF mRNA的表达。原位杂交结果显示,培养的HUVEC中未见VEGF mRNA的表达,当ox-LDL刺激后可见VEGF mRNA的高表达,加入迷迭香酸后阳性反应明显低于ox-LDL组。酶联免疫吸附试验结果显示,ox-LDL可使HUVEC细胞条件培养基中VEGF蛋白表达明显增加,迷迭香酸可明显降低其含量。以上结果显示,ox-LDL能诱导HUVEC表达高水平的VEGF,迷迭香酸可明显降低其含量。
【关键词】氧化修饰低密度脂蛋白;迷迭香酸;血管内皮生长因子;酶联免疫吸附试验;免疫组织化学
Effects of oxidized low density lipoprotein (ox-LDL) on the Expression of Vascular
Endothelial Growth Factor in HUVEC and the Inhibitory Effect of rosmarinic acid �1
MA Ming�chuan
【Abstract】AimTo study the effect of oxidized low density lipoprotein (ox-LDL) on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in human umbilical vein endothelial cell line (HUVEC) and the inhibitory effect of rosmarinic acid (RAD) in vitro. MethodsExposured to 50 mg.L-1 ox-LDL or ox-LDL +RAD for 24 hours, VEGF protein in HUVEC cells conditioned media of each group were determined by enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).Meanwhile, VEGF mRNA expression in HUVEC was examined by in situ hybridization.Results ox-LDL upregulated VEGF protein and VEGF mRNA expression in the HUVEC cells.RAD could markedly inhibit the ox-LDL-induced increasing of VEGF(P[1],通过旁分泌方式作用于内皮细胞,促进内皮细胞增殖、生理性和病理性血管生成及血管通透性的增加[2]。由于在动脉粥样硬化斑块组织中,VEGF mRNA的表达明显升高,故推测VEGF可能在动脉粥样硬化(AS)早期发展中起重要作用[3,4]。目前对氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)作用下,血管内皮细胞VEGF的表达是否有影响尚未见报道。
甘西鼠尾草为唇形科鼠尾草属植物,喜光,耐寒,为我国特有植物,对其有效成分的研究不多。迷迭香酸为甘西鼠尾草中提取得一类水溶性成分,它存在于多种植物如丹参[5]中。目前对迷迭香酸的研究多集中于抗炎、镇痛、解痛作用,而对其心血管方面的作用研究不多[6]。本实验旨在研究迷迭香酸对ox-LDL所致的VEGF分泌增加是否具有抑制作用。
1 材料与方法
1.1 内皮细胞的培养及条件培养基的收集:
HUVEC细胞(购于北京科恩公司)用含10%小牛血清(华美生物工程公司)的Dulbecco’smAified Eagle’s medium (DMEM; Gibco)培养基培养,待细胞长成致密单层后,用0.1%的胰酶(Sigma)消化,调整细胞数为1×10�5个/ml,按每瓶5ml接种于培养瓶中,置37℃,5%CO2孵箱中孵育48h后,可汇合成单层细胞,换以无血清培养基,静息24h,以消除血清的影响。将准备好的细胞单层换以含50mg/L ox-LDL(Sigma)的无血清DMEM培养基刺激24h,取其上清液,离心5min,用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测VEGF的表达。损伤组加入50mg/L ox-LDL,药物组同时加入50mg/L ox-LDL+RAD(使终浓度为1.0×10-9, 1.0×10-8和1.0×10-7mol/L)共孵,对照组只加无血清DMEM培养基。
1.2 酶联免疫分析方法测定上清液中VEGF蛋白的0含量:
在兔抗鼠IgG-HRP (SABC)包被的96孔酶标板相应位置加入100μl不同浓度的VEGF标准品(0,0.0239, 0.0597, 1.531, 6.125, 25μg/L)及100μl CM,与4mg/L鼠抗人VEGF抗体(Santa Cruz)室温孵育3h后,加入25μl 兔抗鼠IgG-HRP (1∶1000),室温孵育30min。缓冲液洗板5次,加入100μl 含0.01%H2O2的邻苯二胺盐酸盐,室温显色25min,50μl 2mol/L氢氧化钠终止反应。以酶标仪测定492nm处吸光度值(Absorbance)。
1.3 原位杂交测定中VEGF蛋白的含量:
细胞在24孔培养板内放置盖玻片,调整HUVEC细胞数为5mL,待细胞长满后弃去培养基,换以无血清DMEM继续培养24h。加入含ox-LDL(50mg/L)的DMEM培养基0.5mL。药物组加入RAD(终浓度为1.0×10-9,1.0×10-8和1.0×10-7 mol/L),对照孔只加DMEM培养基0.5mL。37℃, 5%CO2孵箱中培养24h,取出盖玻片,15%甲醛固定15min。加入含0.25%乙酸酐的0.1mmol/l的TEA缓冲液,乙酰化处理10min。37℃预杂交15min后加入含地高辛标记的cRNA探针(Santa Cruz)的杂交缓冲液,切片加盖后于42℃湿盒中过夜孵育。PBS洗涤后以含20mg/L RNase的NTE缓冲液去除未杂交的探针 ,用地高辛检测试剂盒(Boehringer Mannheim)显色。脱水,封片。
1.4 统计学方法:
所得数据均采用(±s)的形式,并进行t检验。
2结果
2.1 内皮细胞培养上清液中VEGF蛋白含量的表达:
以已知VEGF浓度为横坐标,以其相应吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,得到一条拟合的直线方程y=-0.0361x+0.131(R�2=0.9901. n=3)。HUVEC细胞中VEGF蛋白含量为(1.21±0.04)μg/L,当HUVEC细胞暴露于ox-LDL后,VEGF蛋白含量显著增加,为(2.39±0.06)μg/L。加入RAD后,VEGF蛋白含量明显降低,当迷迭香酸为1.0×10-9 mol/L时,VEGF蛋白含量为(0.67±0.05)μg/L,当迷迭香酸为1.0×10-7mol/L,时,VEGF蛋白含量为(0.28±0.07)μg/L,与ox-LDL组相比降低9倍。差异有显著性意义(P[7]。在诸多引起内皮损伤的有害刺激中,LDL和氧化修饰的低密度脂蛋白(ox-LDL)是引起内皮功能紊乱的重要物质[8,9]。
氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)是ox-LDL的主要成分。近年来研究发现,ox-LDL具有细胞毒性,使内皮细胞变性、坏死、脱落,据报道,ox-LDL引起的细胞损伤与其氧化性有关,维生素E可拮抗ox-LDL对EC的作用[10]。 Ox-LDL还可激活血管内蛋白激酶C而进一步氧化修饰LDL,使其生成ox-LDL。在LDL氧化过程中40%磷脂酰胆碱可转变成ox-LDL。此外,在喂食致As饲料的动物模型中发现动脉损伤处测得ox-LDL的浓度明显升高。因此研究ox-LDL对EC表达VEGF的影响对于阐明As的形成机制有一定的意义。本实验表明,ox-LDL不仅增加HUVEC细胞VEGF蛋白的表达,而且能促使VEGF mRNA高表达 ,提示在动脉粥样硬化的发生发展过程中,ox-LDL与VEGF可能共同发挥作用。
迷迭香酸是从我国特有植物甘西鼠尾草中提取得一种水溶性化合物,它对H2O2引起的大鼠红细胞溶血和脂质过氧化有显著的抑制作用[11],对由Vit C-NADPH或Fe2+-半胱胺酸诱发的大鼠肝、肾、脑微粒体的脂质过氧化也都有很强的一种作用[12]。本实验发现,迷迭香酸可明显抑制VEGF蛋白及VEGF mRNA的高表达,提示在预防和治疗动脉粥样硬化的药物中,迷迭香酸具有良好的发展前景,其作用机制尚待进一步研究。
参考文献
[1] Banai S, Jaklitsch MJ. Pituitary follicular Cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells.Biochem Biophys Res Commun1989; 161:851-858
[2] Ferrara, H, Houck K, Jakeman L, et al.Molecular and biological properties of the vascular endothelial growth factor family of proteins.Endocrinol. 1992; 13:18-32
[3] Inoue-M, Itoh-H, Ueda-M, et al.Vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in human coronary atherosclerotic lesions: possible pathophysiological significance of VEGF in progression of atherosclerosis.Circulation Nov 17 1998; 98(20):2108-2016
[4] Ramos MA, Kuzuya M, Esaki T, Miura S, Satake S, Asai T, et al.Induction of macrophage VEGF in response to oxidized LDL and VEGF accumulation in human atherosclerotic lesions.Arterioscler-Thromb-Vasc-Biol 1998; 18(7):1188-1196
[5] 黄炼栋,周吉燕,刘涤,胡之壁.丹参组织培养研究的水溶性成分研究[J]. 上海中医药大学学报,1999,13(4):56-9
[6] 刘鹰翔,计志忠.迷迭香酸药理作用的研究进展[J]. 国外医学植物药分册,1993,8(6):248-51
[7] Kaneko M, Hayashi J, Saito I, et al. Probucol downregulates E-seledin expression on cultured human vasculer endothelial cells. Arterioscler Thromb1996; 16:1047-1051
[8] Steinberg D, Witatum JZ. Lipoproteins and atherogenesis: current concepts.JAMA (J Am Med Assoc)1990; 264:3047-3052
[9] Steinberg D, Parthasarathy S, Larcw TE, et al. Beyond cholesterolmAifications of low-density lipoprotein that increase it’s atherogenicityN Engl J Med1989; 320:915-924
[10] Scott M, Colles and Guy M Chisolm.Oxidized low density lipoprotein-induced cellular injury in cultured fibroblasts involves oxidative events.J Lipid Res. 2000 Aug;41(8):1188-1198
[11]陈淑珍,付阳平,吴若�.迷迭香酸对大鼠中性粒白细胞自由基生成和溶酶体释放的影响[J]. 药学学报,1999,34(12):881-5
[12] Huang YS, Zhang JT. Antioxidative effect of three watersoluble components isolated from Saviae miltiorrhizae in vitro[J]. Acta Pharm Sin, 1992,217:96
作者单位:455000 河南省安阳市肿瘤医院
