【www.zhangdahai.com--卫生防疫公文】
[摘要]目的建立洛伐他汀片剂有关物质的HPLC测定方法,并同时考察了全国数批洛伐他汀片剂的有关物质。方法使用C18柱,以乙腈-0.01%磷酸(60:40)为流动相采用线性梯度表洗脱,检测波长为238nm。结果洛伐他汀片剂中主峰及其有关物质色谱保留时间适宜,分离良好。结论方法准确、灵敏度高,本方法可有效地控制药品质量。
[关键词]洛伐他汀片剂;有关物质;高效液相色谱法
洛伐他汀(Lovastatin)为降胆固醇药,能减少肝脏生成胆固醇量。临床用于降低血清总胆固醇,低密度脂蛋白,极低密度脂蛋白和甘油三脂。并能升高高密度脂蛋白。本品口服制剂在临床上应用范围很广泛。
洛伐他汀系发酵产品,发酵液中含有与其结构功能相似的同类药物较多,各国药典均控制其有关物质。其片剂虽收载于国家药品标准[1]和USP标准[2]中,但未对其有关物质进行控制。本文所采用的梯度法流动相系统,对洛伐他汀片剂及有关物质实行了很好的分离。实验结果表明,该方法准确、可靠、灵敏度高,可检测有关物质。本方法将收载到中国药典2010年版二部。
1.实验部分
1.1仪器与试药
岛津LC-2010CHT高效液相色谱仪,Agilent1200高效液相色谱仪;乙腈为色谱纯,磷酸为国产分析纯,水为去离子水。洛伐他汀对照品为中国药品生物制品检定所提供,批号为:100600-200502,辛伐他汀对照品为中国药品生物制品检定所提供,批号为:100601-200502,洛伐他汀片剂为国内药厂产品。
1.2色谱条件
供试品溶液的制备:取本品20片,精密称定,研细,精密称取细粉适量(约相当于洛伐他汀40mg),置100ml量瓶中用乙腈溶解并稀释至刻度,摇匀。
对照溶液的制备:取上述供试品溶液1ml,置100ml量瓶中,加乙腈稀释至刻度,摇匀。
2.方法建立与评价
2.1色谱条件的选择
2.1.1色谱柱的选择
由于洛伐他汀容量因子较大,故EP6.0及BP2008原料有关物质方法中均选用C8柱测定,USP31选用C18柱测定。因C18柱适用范围更广,而我们考察了七根不同厂家、不同填料、不同柱长的色谱柱进行试验,发现均可将洛伐他汀片剂样品进行有效分离,故选择了C18柱测定。
2.1.2流动相的选择
2.1.2.1流动相组分的选择由于乙腈的洗脱强度大于甲醇,同时对比国家药品标准、USP31及EP6.0各国药典原料的方法,选择乙腈和磷酸溶液作为流动相组成。
首先尝试用等度洗脱进行有关物质检查,结果出峰时间太长,可能还有杂质峰难以洗脱。参考USP31和EP6.0方法,并在现行标准的基础上,采用C18柱,乙腈-磷酸溶液进行梯度洗脱,即保证了主峰前杂质峰的有效分离,又使出峰较迟的杂质通过梯度洗脱能被有效检出,提高了现有质量标准的有效性。
2.1.2.2磷酸溶液pH值及浓度的确定国外药典和我国现行原料标准中,都在流动相中控制pH值为弱酸性,其主要目的是为了避免载体硅胶对洛伐他汀的杂质――开环的洛伐他汀羧基酸(也叫加氢洛伐他汀,是洛伐他汀的降解产物)作用而引起拖尾的影响。另外,洛伐他汀在pH值稍偏高时即会开环产生其降解产物―加氢洛伐他汀,这点由碱破坏试验可看出。所以我们分别考察了流动相pH值为2.5、3.5、4.5、5.5的水溶液(用磷酸调节pH值),按上述梯度表进行洗脱,结果发现溶液的pH值对分离分析无显著影响,主峰峰型对称,与杂质峰分离完全,保留时间无差异。可见pH值对杂质峰保留时间影响不大,只需保证酸性条件即可。
分别采用0.1%和0.01%磷酸溶液进行试验,两者差异不大。
故流动相B最后选定0.01%磷酸溶液,无需调节pH值,简化了操作。同时,因无磷酸盐的加入磨损,对色谱柱及仪器本身也起到保护作用。
2.1.3检测波长的选择
取洛伐他汀对照品,加乙腈溶解并稀释制成约10?g/ml的溶液,在400～200nm波长范围内扫描,洛伐他汀在238nm处有最大吸收。
为保证所选色谱条件可最大限度的检出杂质总数及杂质量,用二级管阵列检测器在200～400nm的紫外光区对方法专属性下破坏试验的溶液进行检测,洛伐他汀主峰在238nm波长处有最大吸收且为单一峰,所得到的杂质大多最大吸收波长为238nm,其余杂质在238nm的波长处也有吸收,故选择238nm为检测波长。见图1。
图1热破坏图谱DAD检测(238nm图谱)
2.1.4溶剂的选择
国外药典均采用乙腈作为溶剂,而我国现行标准溶剂选择为流动相。但因洛伐他汀结构中有一个内酯环,在酸性或碱性环境中,内酯环都很容易水解打开,形成加氢洛伐他汀的降解产物。这点从方法专属性试验中的酸碱破坏结果即可看出,该降解物的峰面积都大大增加。
如果选用拟修订的流动相乙腈-0.01%磷酸溶液(60:40)作为溶剂,即采用了酸性的流动相,通过溶液稳定性试验可以看出,分析时间如超过二个小时,因为试验酸性流动相而引起的降解产物将达到0.1%以上,时间越长降解产物越大,这样有关物质的测定将会受到影响。
也曾选择乙腈-水(60:40)作为溶剂,作有关物质检查,结果如放置4h以上,大部分样品的最大杂质均为水解形成加氢洛伐他汀,不能反映样品的真实情况。
因洛伐他汀在乙腈中溶解,为避免引入其他杂质,故选择乙腈作为溶剂。
2.2系统适用性要求的确定
实验表明,在所试验的7种色谱柱上,该色谱系统的理论塔板数较高,均达到10000以上;与辛伐他汀的分离度R均大于5,与相邻杂质峰的分离度R均大于1.5,拖尾因子T均在0.9～1.35之间;重复进样的相对标准偏差均小于2%。根据上述系统适用性的结果;考虑到国外药典原料标准中的系统适用性要求,拟定标准规定与辛伐他汀的分离度不小于5.0;与相邻杂质峰的分离度应符合规定。系统适用性图谱见图2。
2.3方法的专属性考察
将样品在酸、碱、氧化、高温、高湿及强光下进行破坏,并将处理好的溶液按上述液相色谱条件测定,发现加速破坏所产生的杂质峰与主峰均得到基线分离。
2.4检测限
将对照溶液逐步稀释进样,当信噪比S/N≥3时,洛伐他汀浓度为0.025?g/ml,最低检测限为0.25ng。
2.5溶液的稳定性
将同一样品的溶液,在0、2、4、6、8、12、24h分别进样,考察溶液的稳定性。结果表明:在室温情况下,放置24小时后杂质量有所增加,而供试品溶液室温放置12h基本稳定。因此,所配制的溶液可在12h内使用。
2.6重复性试验
取洛伐他汀片剂一批,照制订的色谱条件试验,平行测定6份。6份测定结果杂质总量RSD为1.5%。方法重复性良好。
2.7样品测定
对6个厂家的12批洛伐他汀片剂,按上述供试品溶液制备方法制得样品溶液,依法测定,计算,结果见表1。
3.讨论
3.1由于洛伐他汀系发酵产品,在现有的提取工艺下,洛伐他汀原料中常带有美伐他汀、加氢洛伐他汀、脱水洛伐他汀和洛伐他汀二聚体等杂质,而且由于片剂在制作过程中需经过混料、压片等工艺,其生产过程中可能使原料降解或带入一些其他杂质。而随着人们对药物安全性问题的日益重视和检测手段的不断发展,对药品中有关物质的控制已越来越受重视,对制剂的有关物质也应严格进行控制。尤其根据本次试验结果,发现片剂的有关物质无论是单一杂质还是杂质总和,比照原料都有所增加,所以增订有关物质检查是很有必要的。本方法可将所有杂质均检出,并进行测定,方法成熟、完善,具有较高的专属性。
3.2本方法采用磷酸水溶液及乙腈,较原局颁标准含量测定方法中使用缓冲盐对色谱柱及仪器的危害要小很多,说明本方法具有更好的适用性。
3.3通过对洛伐他汀片剂方法的研究,不仅可以进一步提高产品质量标准,同时对洛伐他汀片剂的生产过程进行质量监控,对提高产品的质量、产品的安全性及稳定性有重大意义。还使其与国际产品同步,为打开国际市场创造了先决条件,将来可为国家创造更好的经济效益和社会效益。
