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【摘要】 目的 检测apoE基因缺陷小鼠肝脏CuZnSOD基因CpG岛甲基化状态，探讨其与动脉粥样硬化发生发展的关系以及在动脉粥样硬化早期基因诊断中的意义。方法 ApoE基因缺陷小鼠是用来建立动脉粥样硬化的成熟模型,本实验将18例7周龄apoE基因缺陷雄性小鼠及作为对照的18例7周龄正常的C57BL/6J雄性小鼠分别随机分成三组,在饲养至0周、7周、14周时取其肝脏，运用甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR,MSP）法检测肝脏CuZnSOD基因CpG岛甲基化情况。结果 不同时间段apoE基因缺陷小鼠与正常的C57BL/6J小鼠CuZnSOD基因CpG岛甲基化差异无统计学意义。结论 apoE基因缺陷小鼠肝脏没有发生CuZnSOD基因启动子区CpG岛的异常甲基化，可能CuZnSOD基因启动子区CpG岛的异常甲基化没有参与动脉粥样硬化的发生发展。�
【关键词】 动脉粥样硬化；CuZnSOD；甲基化
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DNA甲基化是DNA分子复制后的一种共价修饰方式，导致DNA结合蛋白与DNA主螺旋沟的结合能力降低，从而在不改变基因结构的基础上够调控基因的表达。本研究运用甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR,MSP）对apoE基因缺陷小鼠与正常的C57BL/6J小鼠肝脏CuZnSOD基因启动子区CpG岛甲基化状态进行检测，以探讨CuZnSOD基因甲基化与AS发生发展的关系。�
1 材料和方法�
1．1 标本来源 本研究采用7周龄雄性apoE基因缺陷小鼠，该小鼠购自美国Jackson实验室，由中山大学北校区实验动物中心繁殖提供；此外本研究还采用7周龄雄性C57BL/6J小鼠（清洁级）为对照，由中山大学北校区实验动物中心提供。将18只7周龄apoE基因缺陷小鼠和18只正常的7周龄C57BL/6J小鼠饲养一周以适应环境后随机各分成三组，将第一组小鼠处死，余以AIN-93G饲料分别饲养至第7周和第14周处死，分离小鼠肝脏，－80℃冻存待测。�
1．2 试剂和仪器 95％乙醇购自安徽安特生物化学有限公司；氢氧化钠购自广州化学试剂厂；亚硫酸氢钠、氢醌购自Sigma公司；醋酸钠、醋酸购自汕头市化学试剂厂；无水乙醇购自天津富宇精细化工有限公司；DNA 提取试剂盒购自TaKaRa公司（日本）; Wizard plus sv minipreps DNA Purification system购自 promega公司；PCR引物由上海生工合成；PerfectShotTM Taq(Loading dye Mix)、50 bp DNA Ladder Marker购自Takara公司；琼脂糖购自西班牙Biowest；Tris碱购自Sigma公司；Na2EDTA．2H2O、硼酸购自天津市福晨化学试剂厂；分析天平（Swiss Mettler AE160公司）；-80℃低温冰箱（Japan SANYO 公司）；低温高速离心机（Germany eppendorf 公司）；梯度PCR仪（Germany Hybaid GmbH 公司）；BIO-RAD电泳仪、电泳槽（U．S．A Bio-Rad 公司）；凝胶成像及分析系统（France Vilber Lourmat 公司）。�
1．3 方法�
1．3．1 肝脏DNA的提取 将分离出来的肝脏取50 mg放入研钵中，加液氮研磨至粉末状，然后加入650 μl solution A和0．9 μl 的RNase A1后，再研磨1 min。收集650 μl研磨好的组织匀浆移至2．0 ml collection tube中，加入1 ml的4℃预冷的solution C及400μl的solution B，弃去上层有机相，然后将水相溶液（无色下层）转移至置于collection tube 的Filter cup中，12,000rpm离心1 min。最后12,000rpm离心1 min洗脱DNA，-20℃保存备用。具体实验步骤严格按照Universal Genomic DNA Extraction Kit (TaKaRa)说明书进行。�
1．3．2 模版DNA亚硫酸盐修饰 取DNA 2 μg，加双蒸水至46．7 μl。然后加入3 mol/l NaOH 3．3 μl， 37℃水浴10 min，使DNA充分变性。加入10 mM氢醌 30 μl及3 mol/l NaHSO 3 52O μl(pH 5．0)（氢醌和NaHSO3要新鲜配制），在上面加矿物油100 μl，53℃孵育16 h。将处理过的DNA溶液转移至wizard column中过柱，加入54 μl双蒸水（65℃）洗脱DNA， 在虑液中加入3 mol/l NaOH 6 μl、6 μl 3 mol/l的醋酸钠（pH5．2）、150μl冻无水乙酸，混匀，-40℃ 5 h。4℃ 13 000 rpm离心20 min，弃去上清液，用75％的冻乙醇洗涤沉淀两次，干燥，然后用30 μl双蒸水溶解DNA，储存在-20℃冰箱中待用。�
1．3．3 统计学方法 实验数据用Microsoft Excel 2003建立数据库，采用SPSS 12．0软件进行统计分析，甲基化结果用Fisher精确概率检验法分析。�
2 结果�
小鼠肝脏CuZnSOD基因启动子甲基化状况如表1所示，不同时间不同实验组小鼠间的差异没有统计学意义，(P>0．05)。�
3 讨论 �
本次实验结果表明，apoE基因缺陷小鼠和其同种遗传背景的C57BL/6J小鼠CuZnSOD基因的甲基化状态差异没有统计学意义，有三种可能性，一是CuZnSOD基因没有参与AS过程中DNA甲基化的异常改变，其启动子区CpG岛的甲基化没有参与该基因的表达调节；另一种可能是因为观察的结局指标为率，因此每组6个动物，样本量偏少，未能正确显示出相应的结果；三是在CuZnSOD可能并没有参与动脉粥样硬化的发生发展。有实验表明，过表达的apoE基因缺陷小鼠体内，其脂质过氧化和动脉粥样硬化的发展并没有得到缓解，机制尚不明确。基因CpG岛的高甲基化会导致其低表达，Gertrud Lund等的研究表明，在apoE基因缺陷的小鼠尚未出现任何组织学上可以检测的血管病变时，DNA甲基化的异常在主动脉和外周血单核细胞中已经出现。目前临床上对动脉粥样硬化没有很理想的治疗方案，如果能在其发生发展早期准确检测到相关基因的异常甲基化，无疑对动脉粥样硬化的防治及预后有很大的帮助。�
CuZnSOD在动脉粥样硬化的发生发展过程中是否发生了启动子区CpG岛甲基化的异常改变以及它可能的抗动脉粥样硬化的作用是否通过甲基化途径来发挥还有待更多的实验来证实。�
参考文献
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