【www.zhangdahai.com--调查报告】
【摘要】目前的现状是造成感染性疾病的微生物种类日益复杂,常见病原微生物的威胁不仅没有消除 ,加之一些新病原体的出现,给临床诊断和治疗带来了很大的困难。因此,不断探索各种病原微生物的检测技术 ,对感染性疾病的治疗和预后有重要意义。
【关键词】感染;病原微生物;检测技术
【中图分类号】R446.5 【文献标识码】A 【文章编号】1006-1959(2009)08-0223-01
1 生化方法
生化方法检测病原微生物实际上是测定微生物特异性酶。由于各种微生物所具有的酶系统不完全相同,对许多物质的分解能力亦不一致。因此可利用不同底物产生的不同代谢产物来间接检测该微生物内酶的有无,从而达到检测特定微生物的目的。如沙门氏菌能产生辛酯酶,这一性能是除沙门氏菌外的各属肠杆菌科细菌所不具备的。根据这一特性,甄宏太等报道了快速检测沙门氏菌的辛酯酶法。该方法是以4-甲基伞形酮辛酯(MUCAP)为底物,经沙门氏菌的酶降解后,释放出4MU,在紫外灯下观察其发出的蓝色荧光。该方法简便易行,从加入底物到紫外灯下观察到出结果仅需几分钟即可完成。其灵敏度和特异性分别可达95%和90%。对与H2S(+)反应的沙门氏菌该法更为敏感,灵敏度和特异性均接近100%。大肠埃希氏菌具β-葡萄糖醛酸酶,但以O157∶H7为代表的肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)却不具此酶,故β-葡萄糖醛酸酶阴性已成为初步筛查EHEC的重要特征。白色念珠菌具脯氨酸肽酶及N-已酰β-D半乳糖苷酶,分别以合适的试剂检测,两酶均阳性即为白色念珠菌。
2 血清免疫学方法
免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应,观察和研究组织细胞、特定抗原(抗体)的定性和定量技术。为了显示和观察这种抗原抗体反应,需要预先将某种标记物结合到抗体上,借标记物的荧光或酶的有色反应、放射性或高电子密度,在光镜或电镜下进行定性、定位或定量研究。各种形式的免疫分析方法如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、间接酶联免疫吸附(ELISA)、荧光免疫分析(FIA)、生物发光免疫分析(BIA)、化学发光免疫分析(CIA)等,直接检测微生物或通过间接检测微生物的成份及微生物代谢产物(如毒素)检出微生物。各大文献数据库提供的数据显示,几乎建立了所有病原体的血清学检测方法,表明该方法也成为了一种实验室常用的成熟的检测技术。
2.1 荧光抗体技术:
荧光抗体技术是根据抗原抗体反应具有高度的特异性,把荧光素作为抗原标记物,在荧光显微镜下检查呈现荧光的特异性抗原抗体复合物及其存在部位。荧光抗体技术的主要特点是特异性强、速度快、灵敏度高,但也存在许多的缺点,如非特异染色问题难以完全解决、操作程序较烦琐、需要特殊的昂贵仪器(荧光显微镜)和染色标本不能长期保存等。用于快速检测病原菌的荧光抗体技术主要有直接法和间接法。直接法是在检测样品上直接滴加已知特异性荧光标记的抗血清,经洗涤后在荧光显微镜下观察结果。间接法是在检测样品上滴加已知的细菌特异性抗体,待作用后经洗涤,再加入荧光标记的第二抗体。如市场上广泛应用的抗沙门氏菌荧光抗体和猪瘟荧光抗体。吕治林等[4]报道的由美国同行所作的用炭疽杆菌细胞壁(CW-DFA)和荚膜抗原(CAP-DFA)特异的荧光标记的单克隆抗体,可快速鉴别炭疽杆菌。
2.2 酶免疫技术:
酶联免疫技术是根据抗原-抗体的免疫反应与酶的高效催化作用原理有机结合,通过酶催化底物进而发生一系列的化学反应,使溶液呈现出颜色变化,从而显示抗原抗体特异性反应的存在。酶联免疫技术的应用,大大提高了检测的敏感性和特异性,现已被广泛地应用于多种病原微生物的检测。应用单克隆抗体结合硝酸纤维膜上的斑点ELISA技术,已成功地自患者的咽拭标本中同时检出可能存在的肺炎支原体、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和3、7型腺病毒。涂少华等用MP膜结合蛋白抗原制备MP单抗来建立双抗体夹心ELISA检测肺炎支原体抗原方法,与PCR方法的符合率达95%; Gehring等用酶联免疫化学发光法(ELIMCL)测定大肠杆菌O157∶H7,在PBS缓冲液中,检测极限约为7.6×10�3个活细胞。许多疾病的检测都已有商品化的试剂盒出现。如直接自尿中检出沙眼衣原体的商品试剂盒IDEIA-Ⅲ。
3 分子生物学方法
分子生物学及分子遗传学的发展,使人们对微生物的认识逐渐从外部结构特征转向内部基因结构特征,微生物的检测也相应的从生化、免疫方法转向基因水平的检测。
3.1 核酸杂交法:
最初应用于微生物检测的分子生物学技术是基因探针方法,它是用带有同位素标记或非同位素标记的DNA或RNA片段来检测样本中某一特定微生物核苷酸的方法。核酸杂交有原位杂交、打点杂交、斑点杂交、Sorthern杂交、Northern杂交等,它们共同的特点是:①都是应用复性动力学原理;②都必须有探针的存在。核酸分子探针又可根据它们的来源和性质分为DNA探针、cDNA探针、RNA探针及人工合成的寡聚核苷酸探针等。该法诊断的原理是通过标记根据病原体核酸片段制备的探针与病原体核酸片段杂交,观察是否产生特异的杂交信号。核酸探针技术具有特异性好、敏感性高、诊断速度快、操作较为简便等特点。目前,已建立了多种病原体的核酸杂交检测方法,尤其是近年来发展起来的荧光原位杂交技术(FISH)更为常用。
3.2 PCR及其衍生技术:
PCR技术又称体外扩增技术,自1985年发明以来,因其高度灵敏性和良好的特异性受到了人们的高度重视,短短20年的时间,各种各样以PCR为基础的DNA序列的扩增和检测方法得到了迅猛发展,几乎已应用于基础研究的各个领域,并且成为医学临床和检验部门强有力的分析工具。各种衍生技术如反转录PCR(RT-PCR)、多重PCR、巢式PCR、PCR单链构象多态性(PCR-SSCP)、RFLP、RAPD技术、荧光定量PCR等。其中定量PCR既可以用于临床感染性疾病的诊断,又可用于监测其疗效。而DNA测序分析可用于病原菌的鉴定和亚型的区分,以及同种病原菌不同菌株的区分。
4 生物芯片
生物芯片技术是将生物大分子,如寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、肽、抗原以及抗体等固定在诸如硅片、玻璃片、塑料片、凝胶和尼龙膜等固相介质上形成生物分子点阵,当待测样品中的生物分子与生物芯片的探针分子发生杂交或相互作用后,利用激光共聚焦显微扫描仪对杂交信号进行检测和分析。根据生物芯片上探针的分子种类而将之分为DNA芯片(即基因芯片)和蛋白质芯片。微生物检测基因芯片是指用来检测样品中是否含有微生物目的核酸片段的芯片。基于高通量、微型化和平行分析的特点,微生物检测基因芯片在微生物病原体检测、种类鉴定、功能基因检测、基因分型、突变检测、基因组监测等研究领域中发挥着越来越重要的作用。
参考文献
[1] 陈剑刚. B/T15481-2000标准在卫生检验质量控制中的应用[J].中国卫生检验杂志,2007,12(4):487
[2] 杨贵贤.微生物学报, 2006, 36(1)
作者单位:435000 湖北省黄石理工学院高职院
