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【摘要】目的：观察蒲地蓝消炎颗粒的微生物限度。方法：采用培养基稀释法（0.2 ml/皿）和离心薄膜过滤法,消除蒲地蓝消炎颗粒中抑菌成分,对样品中的微生物进行检测。结果：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率均达到70%以上。结论：所建立方法检查蒲地蓝消炎颗粒的微生物限度可行。
【关键词】蒲地蓝消炎颗粒；培养基稀释法; 离心薄膜过滤法
文章编号：1009-5519（2008）16-2425-02 中图分类号：R28 文献标识码：A
蒲地蓝消炎颗粒临床用于清热解毒，抗炎消肿[1]。在进行微生物限度方法学验证时发现有较强广谱抑菌作用，选用的5种代表菌株除枯草芽孢杆菌外的回收率均达不到70%[2]，我们采用培养基稀释法和离心薄膜过滤法消除本品的抑菌作用。
1 仪器与材料
HTY-←Ⅲ型智能集菌仪及开放式滤器和0.45 ?滋m滤膜（杭州泰林医疗器械厂）；玻璃器皿:培养皿、量筒、刻度吸管；培养基:营养肉汤、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液；对照菌：枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501第三代、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003第三代、大肠埃希菌CMCC（B）44102第三代、白色念珠菌CMCC (F) 98001第三代、 黑曲霉CMCC (F) 98003第三代。供试品: 蒲地蓝消炎颗粒(批号20060512生产厂家; 四川百利药业有限责任公司)。
2 试验方法
2.1 常规法
2.1.1 菌液制备：(1)取经35 ℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的肉汤培养物1 ml加9 ml无菌0.9%氯化钠溶液，10倍稀释至10-5～10-7，细菌数约为50～100 cfu/ml，做活菌计数备用。(2) 取经25 ℃培养18～24小时的白色念珠菌真菌液体培养物1 ml加9 ml无菌0.9%氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-7，菌落数约为50～100 cfu/ml，做活菌计数备用。(3)取经25 ℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加3～5 ml无菌0.9%氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，然后取1 ml 加9 ml生理盐水，逐管10倍稀释为10-5，细菌数约为50～100 cfu/ml，做活菌计数备用。
2.1.2 试验组：取样品10 g 加pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液100 ml，为1∶10供试液。分别取1∶10供试液1 ml、试验菌株1 ml同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定的温度培养24～72小时观察结果。每株试验菌平行制备2个平皿。细菌与真菌计数,测定回收率。结果见表1。
2.1.3 活菌组：测定每一菌株的试验菌数。分别取1 ml试验菌株加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24～72小时观察。每种试验菌株制备2个皿。
2.1.4 供试液对照：测定供试品本底菌数。取1∶10供试液1 ml加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定的温度培养24～72小时观察结果。细菌、真菌及酵母菌平行制备2个平皿。
2.1.3 用常规法测定细菌，真菌和酵母菌的回收率，除枯草芽孢杆菌的回收率大于70％，其它4种菌的回收均小于70%，说明本品有抑菌作用。
2.2 采用培养基稀释法消除供试品中的抑菌作用
2.2.1 试验组：取1∶10供试液0.2 ml；1.0 ml试验菌株(50～100 cfu)同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24～72小时观察。每种试验菌株制备2个皿，测定回收率。活菌组和供试液对照同常规法。结果见表2。
由上表结果：采用培养基稀释法(0.2 ml/皿)检验，人工污染5株代表菌株，该供试品对5种菌三次独立实验回收率均大于70％，故可采用培养基稀释法(0.2 ml/皿)检验细菌数、真菌和酵母菌数。
3 控制菌检查法
3.1 菌液的制备：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌菌液同细菌、霉菌和酵母菌计数方法菌液的制备。
3.2 供试液的制备：采用常规方法制备，取供试品10 g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 ml，混匀，以500转/分离心5分钟，取上清液为1∶10供试液。
3.3 检查：分别取1∶10供试液10 ml,接种至3瓶100ml胆盐乳糖培养基中，其中一瓶加入1 ml大肠埃希菌（50～100个/ml）为阳性菌对照，一瓶加入1 ml金黄色葡萄球菌（50～100个/ml）为阴性菌对照，按大肠埃希菌检查法检验，结果见表3。
阴性菌对照组未检出大肠埃希菌，阳性菌对照未检出。
以上结果可见，采用常规法不可进行本品的控制菌检查，改为先以500转/分，离心5分钟后取上清液薄膜过滤，以100 ml/（膜・次）冲洗滤膜3次，结果见表4。阴性菌对照组未检出大肠埃希菌，阳性菌对照检出。
4 讨论
供试品为不溶性颗粒剂,在制备供试溶液要振摇混匀后,自然放置3～5分钟后取上层液检测。菌液的制备一般在8小时内用较好，菌株传代次数不得超过5代，菌落数最好在50～100 cfu/ml,菌体应有旺盛的生命力。薄膜过滤法注意在加供试液前要用稀释液充分润湿滤膜，使滤膜的能达到最大有效过滤量，加菌回收时，要在最后一次冲洗液加入1 ml菌液。对供试品抑菌活性处理，一般从易到难。
参考文献：
[1] 苏德模，马绪荣. 药品微生物学检验技术[M]. 北京：华龄出版社，2007.01.
[2] 中华人民共和国国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：化学工业出版社，2005.70.
收稿日期：2008-05-20 修回日期：2008-06-12
