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【摘要】 目的 观察血红素加氧酶-1(HO-1)重组乳酸乳球菌同一剂量不同灌胃次数对正常大鼠肠黏膜屏障的影响。 方法 将40只健康雄性SD大鼠随机分为: HO-1重组乳酸乳球菌灌胃一次组(HO1t组，n=8)、HO-1重组乳酸乳球菌灌胃二次组(HO2t组，n=8)、HO-1重组乳酸乳球菌灌胃三次组(HO3t组，n=8)、PBS溶液灌胃一次组(PBS1t组，n=8)和乳酸乳球菌灌胃一次组(LL1t组，n=8)。各组灌胃剂量的容积均为1 ml,每次灌胃间隔24 h，在末次灌胃24 h后取回肠组织,检测肠组织Chiu’s 6级评分、髓过氧化物酶(MPO)活性，同时从右心室抽取血液行细菌学检查。
结果 各组肠黏膜Chiu�s评分比较差异无统计学意义；与LL1t组比较，HO2t组和PBS1t组的肠组织内MPO活性较高，但比较没有统计学意义；HO2t组有1例、HO3t组有2例血培养阳性，其余各组血培养阴性。
结论 HO-1重组乳酸乳球菌对正常大鼠灌胃，不会随着灌胃次数增加而影响肠黏膜屏障的功能。�
【关键词】
乳酸乳球菌；血红素加氧酶-1；肠黏膜屏障；细菌移位
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Effects of lavaged with Lactococcus Lactis recombinant heme oxygenase-1 gene on the rats� intestine mucosa barrier
GAOXin-yue， REN Cong-cai， HAN Jing-jun.
Department of Anesthesiology, The 4th hospital of Shenzhen, Shenzhen,518033,China
【Abstract】 Objective
To research the effect of lavaged with Lactococcus Lactis recombinant oxygenase-1 gene and heme on the rats� intestine mucosa barrier as different times with the same dose. Methods 40 SD healthy male rats were randomly divided into one time lavaged with the LL1t Lactis recombinant HO-1 gene group(HO1t group, n=8), two times lavaged with the LL1t Lactis recombinant HO-1 gene group(HO2t group, n=8), three times lavaged with the LL1t Lactis recombinant HO-1 gene group(HO3t group, n=8), one time lavaged with pure phosptant buffer group(PBS1t group, n=8),one time lavaged with LL1t Lactis group(LL group,n=8).All rats were lavaged with 1 ml dose and 24 h between the times. The Chiu�s grade and MPO activity in the low intestine, the blood in the right ventricle were detected.
Results It was no significantly different in Chiu�s grade between the groups.Compared to the MPO activity of LL1t group, it was higher in HO2t group and HO3t group, but no significantly.1 in HO2t group and 2 cases in HO3t group were detected bacterial, other groups were not find.
Conclusion It is not effects the intestine mucosa barrier function following the lavaged dose of LL1t Lactis recombinant heme oxygenase-1 gene.�
【Key words】
Lactococcus Lactis; Heme oxygenase-1; Intestine mucosa barrier;Bacterial translocation
血红素加氧酶-1(HO-1),是HO家族中最重要的酶，为诱导型酶［1］。生理状态下，消化道中的HO同工酶主要为HO-2， 而HO-1在肠组织中不表达,只有在缺血缺氧等刺激下才开始分泌HO-1［2，3］。本实验室已经证明，利用基因工程原理合成HO-1重组乳酸乳球菌，对正常大鼠灌胃后能够到达回肠组织,原位分泌大量重组HO-1，对失血性休克和/或内毒素血症大鼠，有较好的肠黏膜屏障保护效应，明显减少肠道炎症反应的发生程度［4-9］。同时也证明，HO-1重组乳酸乳球菌对正常大鼠灌胃,单纯增加灌胃剂量和次数不能有效增加回肠HO-1的表达,反而可能使回肠HO-1的表达降低［10］。本实验在上述实验的基础上，进一步研究HO-1重组乳酸乳球菌对正常大鼠灌胃后，是否影响肠黏膜屏障功能？�
1 资料与方法�
1.1 药品和试剂
HO-1重组乳酸乳球菌，本实验室构建合成。磷酸盐缓冲液(PBS)，湖北省武汉博士德生物试剂有限公司出品；乳酸乳球菌素(Nisin)，美国Sigma公司出品；髓过氧化物酶(MPO)活性试剂盒，江苏省南京建成生物试剂公司出品，其余试剂为市售。�
1.2 动物分组
健康、清洁级标准的雄性SD大鼠40只，体重在280~320 g之间，由江苏省徐州医学院实验动物中心提供。根据数字随机表法分为5组:HO-1重组乳酸乳球菌灌胃1次组(HO1t组，n=8)、HO-1重组乳酸乳球菌灌胃2次组(HO2t组，n=8)、HO-1重组乳酸乳球菌灌胃三次组(HO3t组，n=8)、PBS溶液灌胃1次组(PBS1t组，n=8)和乳酸乳球菌灌胃1次组(LL1t组，n=8)。各组灌胃剂量的容积均为1 ml,每次灌胃间隔24 h。所有动物均在实验前适应饲养环境7 d，自由饮食，单独饲养。饲养环境和实验室环境温度保持在22℃～25℃之间。�
1.3 灌胃剂量
将Nisin诱导表达3 h的HO-1重组乳酸乳球菌，离心(8000 g, 5 min)收获菌液， PBS洗3次(10000 g, 1 min)弃上清后，再加入适量的PBS使菌液浓缩10倍(活菌数达5×109 CFU/ml)，用1 ml的细菌悬浮液作为一次灌胃的剂量。在同样条件下培养未转染的乳酸乳球菌NZ9000, 取1 ml的细菌悬浮液作为一次灌胃的剂量。PBS溶液灌胃一次组，用1 ml PBS溶液做为灌胃剂量。�
1.4 组织标本的收集
于末次灌胃后24 h，使用过量水合氯醛麻醉动物，无菌条件下打开胸腹腔，从大鼠的右心室抽取2 ml-3 ml的血液注入血培养瓶中。另距回肠末端取下5 cm长度的一段回肠，其中1 cm用10％甲醛溶液浸泡，余下的回肠立即保存在-80℃冰箱内。�
1.5 检测指标�
1.5.1 组织学检查
光镜(100倍)下观察肠黏膜形态，采用Chiu’s 6级评分法评价肠黏膜损伤程度： 0分为正常；1分为绒毛顶端上皮下间隙增大；2分为上皮层和固有层中度分离；3分为绒毛两侧有大量分离伴有部分绒毛顶端破损；4分为绒毛破损伴有固有层毛细血管大量暴露；5分为固有层破坏、出血及溃疡。�
1.5.2 肠组织MPO活性
采用比色法测量肠组织内的MPO活性，MPO活性大小主要反映组织内的中性粒细胞(PMN)数量，具体操作按照说明书进行。�
1.5.3 细菌移位
将抽取的1 ml血液立即注入血培养瓶中，利用BACTEC9120全自动血培养仪和Bacton Dickinson Bactec 9000 软件发现有细菌生长的血培养瓶，然后再利用生物梅里埃APR鉴定系统鉴定细菌种类。�
1.6 统计学方法
对于定量数据，采用均数±标准差，组内比较用t检验，组间比较用单因素方差分析；使用SPSS 13.0英文版统计软件进行统计分析，P0.05)；与LL1t组比较，HO1t组和HO3t组的MPO活性无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；说明各灌胃组对肠道组织MPO的影响相似。�
2.3 细菌移位
HO1t组、PBS1t组和LL1t组血培养阴性，HO2t组有1例、HO3t组有2例血液细菌培养阳性，移位的细菌按出现次数依次为：大肠杆菌、木糖葡萄球菌、类白喉棒状菌等。�
3 讨论�
肠道功能的改变，首先表现为肠黏膜形态的变化，出现黏膜水肿和绒毛断裂，发生肠黏膜屏障功能减退。通过Chiu�s评分可以判断出肠黏膜受损情况，是反映其功能改变的形态学指标［11］。�
在失血性休克期，肠道内的正常菌群依赖肠道内的营养物质大量繁殖，细菌和(或)其释放的内毒素通过受损的肠黏膜屏障转移到肠道外，这个过程称之为细菌移位。细菌移位导致的炎症介质释放，明显比肠道因缺血缺氧刺激引起的炎症介质释放要多［12］。炎症介质通过激活各种信号通路如激活NF-kB信号通路，导致肠道炎症反应引起肠黏膜屏障功能的改变，甚者引起全身炎症反应综合(SIRS)和多器官功能障碍综合征(MODS)［13］。�
PMN作为人体主要的免疫细胞，发挥重要的免疫防御功能，担负着吞噬消灭外来细菌、病毒及其他微生物的使命。正常情况下，肠道内皮细胞通过细胞间连接和粘附功能，形成有效的肠黏膜屏障，使机体免于外界伤害因素的损害。而在病理情况下，大量活化的PMN通过伪足的机械作用和释放各种氧化物质(ROS)，造成肠黏膜屏障受损，发生肠黏膜水肿和肠黏膜屏障功能减退，这是肠道炎症反应发生的重要机制。而机体则分泌具有保护性机制的酶类［14］，如HO-1。HO-1的保护作用包括：抗炎症反应、抗凋亡、抗纤维化［15］，其保护机制与HO-1降解血红素的代谢产物CO、胆绿素、胆红素、铁蛋白相关。�
另外一些研究发现,细胞中HO-1 的保护作用是有阈值的。HO-1 适量表达,可以减少蛋白质氧化、脂质过氧化及细胞死亡;表达量过高时,则会促进乳酸脱氢酶的释放和降低谷胱甘肽转移酶含量,破坏细胞膜的完整性［16］。�
本实验室采用的乳酸菌表达系统是一种目前国际上高度通用、食品级的NICE系统(Nisin Controlled Expression system)，被广泛地用于外源性基因在乳酸乳球菌中表达［17］,这种食品级微生物能在肠道内存活2~3 d,其本身不攻击肠黏膜并且不引起强的免疫反应［10］。通过外源性的补充肠道内的乳酸乳球菌，可以将它携带的克隆基因带到肠道内，发挥药理作用。�
本研究条件下，各组Chiu�s评分和MPO的差异无统计学意义，说明肠黏膜屏障功能没有发生明显变化。HO2t组和HO3t组发生细菌移位，这可能与大量乳酸乳球菌在肠道内形成的酸胁迫有关［18］，从而对局部细胞的生理功能产生影响，包括破坏细胞膜，抑制多种酶和转运系统的活性等［19］，但这种细菌移位的发生后果以及可能导致的并发症，本研究没有深入值得探讨。因此，在如何提高乳酸工程菌体内分泌重组HO-1的含量,同时不改变胃肠道微环境、破坏肠黏膜屏障等方面需要进一步研究,使乳酸工程菌的基因治疗达到一个理想的效果。�
4 结论�
本研究条件下，HO-1重组乳酸乳球菌对正常大鼠灌胃，不会随着灌胃次数增加而影响肠黏膜屏障的功能。�
参考文献�
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