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[摘要] 目的：探讨caspase-8在卡铂诱导人食管鳞癌细胞凋亡中的作用。方法：流式细胞术分别检测对照组及经卡铂处理的实验组人食管鳞癌细胞株Eca-109、TE-1、TE-10的凋亡率，同时采用RT-PCR及western blotting检测各组细胞表达caspase-8 mRNA及蛋白的变化情况。结果：用终浓度40 μg/ml的卡铂可诱导人食管鳞癌细胞株Eca-109、TE-1、TE-10凋亡，同时发现经卡铂处理组Eca-109、TE-1、TE-10细胞表达caspase-8 mRNA及蛋白水平均呈显著升高趋势。结论：卡铂可增加caspase-8在食管鳞癌细胞中的表达，从而诱导人食管鳞癌细胞凋亡，这可能是卡铂治疗食管鳞癌的分子机制之一。
[关键词] 食管癌；卡铂；caspase-8；凋亡
[中图分类号] R735.1 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721（2011）07（b）-０11－０3
Role of caspase-8 in apoptosis of esophageal squamous cell carcinoma induced by carboplatin
YANG Yubai, WANG Hongmei*
Department of Surgery, The Cangxi Pepole′s Hospital in Guangyuan City, Sichuan Province, Cangxi 628400, China
[Abstract] Objective: To observe the role of caspase-8 expression in apoptosis of esophageal squamous cell carcinoma induce by carboplatin. Methods: The apoptosis rates and mRNA expression levels of caspase-8 were detected in TE-1 cells, TE-10 cells and Eca-109 cells were treated by carboplatin with concentration 40 μg/ml. Results: Carboplatin induced apoptosis of TE-1 cells, TE-10 cells and Eca-109 cells, and caspase-8 mRNA and protein expression levels of TE-1 cells, TE-10 cells and Eca-109 cells were increase in experiment groups. Conclusion: Carboplatin induced TE-1 cells, TE-10 cells and Eca-109 cells apoptosis via changing mRNA expression levels of caspase-8.
[Key words] Esophageal carcinoma; Carboplatin; caspase-8; Apoptosis
食管癌是常见消化道恶性肿瘤之一，其发病在我国具有明显的地域特点，在河北、河南、山西、陕西、湖北、四川等地的发病率高居各种肿瘤发病率的首位。食管鳞癌占食管恶性肿瘤的95%以上，对食管鳞癌发病机制及治疗方法的研究具有非常重要的意义。目前食管癌的治疗手段仍以包括手术、化疗、放疗等在内的综合治疗为主，远期疗效仍不够理想[1-2]。近年来由于肿瘤医学的不断发展，新的抗肿瘤药物不断应用于临床，给食管鳞癌的治疗带来一些新的机会。
卡铂是近年来备受重视的第二代铂类化合物，因其肾毒性、耳毒性、神经毒性及胃肠道反应等明显低于顺铂，常用于实体瘤如小细胞肺癌、恶性淋巴瘤、睾丸肿瘤、卵巢癌及头颈部癌等的化疗中[3-5]。已有研究[6]表明卡铂有抑制食管癌细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡的作用；采用卡铂联合紫杉醇等药物治疗食管癌的临床研究[7-8]结果也表明，卡铂不仅可以提高食管癌治疗的总有效率，而且毒副作用无明显增加，患者耐受性较好，这表明卡铂在食管癌的临床化疗中具有非常高的应用价值。
caspase-8是半胱氨酸蛋白酶超家族中的一员，在Fas/FasL介导的细胞凋亡途径中具有非常重要的作用[9]。已有研究表明caspase-8表达水平与食管癌的发生、发展及转移有密切关系[10-11]。笔者采用卡铂诱导人食管鳞癌细胞株Eca－109、TE-1、TE-10凋亡，并检测这3种细胞表达caspase-8的变化情况，深入研究caspase-8在卡铂诱导人食管癌细胞凋亡过程中的作用机制，为临床应用提供实验依据。
1材料与方法
1.1材料
卡铂注射液购于齐鲁制药厂；RPMI1640培养液、0.05%的胰蛋白酶及胎牛血清购于Hyclone；Annexin-V（FITC）/ PI凋亡检测试剂盒购于杭州隆基生物工程研究所；总RNA提取试剂盒及两步法RT-PCR试剂盒购于GENEAID公司；蛋白提取液为Pierce公司产品，兔抗人caspase-8单克隆抗体、兔抗人β－actin单克隆抗体由Santa Cruz公司提供（USA）。
1.2方法
1.2.1 细胞培养人食管癌细胞株Eca-109、TE-1、TE-10（ATCC）由上海麦莎生物科技有限公司代购。将3种细胞分别接种于25 cm2培养瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，置于37℃、含5% CO2 的恒温培养箱中培养， 待细胞生长至对数生长期开始实验。按数字表法将细胞随机分组，实验组中加入卡铂注射液，使终浓度分别为 40 μg/ml，对照组只加入完全培养液，每组设3个样本，培养24 h后分别收集各组细胞，用于下一步实验。
1.2.2细胞凋亡检测细胞经PBS洗涤离心后，重悬于200 μl Banding buffer中，加入5 μl AnnexinV-FITC混匀，室温避光孵育15 min后，再加入5 μl PI，室温避光孵育5 min，立即上流式细胞仪检测细胞凋亡率，同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为对照。经流式细胞仪分析获得数据，进行统计学分析。
1.2.3 RT-PCR检测各组细胞中caspase-8 mRNA的表达分别收集每组细胞，经PBS离心洗涤后，按试剂盒说明书，提取细胞总RNA，采用两步法进行RT-PCR操作。所用引物序列由华大基因上海鼎安生物科技有限公司设计，caspase-8上游引物5′CAACAAGAGCCTGCTGAAGATA3′；下游引物5′CCTGTCCCTAATGCTGTGAAGT3′，扩增片段长度为235 bp；GAPDH上游引物序列：5′-CATGGGTGTGAACCATGAGAAGTAT-3′，下游引物序列为：5′-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA -3′，扩增片段长度为139bp。取PCR 产物5 μl，用1.5%琼脂糖凝胶电泳成像。
1.2.4 Western blotting检测各组细胞中caspase-8蛋白表达分别收集实验中各组细胞，提取细胞总蛋白，用考马斯亮蓝试剂盒检测蛋白浓度，调整样本浓度基本一致后进行蛋白变性处理。将蛋白样本进行SDS-PAGE凝胶电泳，半干法转膜至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，用兔抗人caspase-8单克隆抗体和β-actin单克隆抗体孵育，4℃过夜。TBST 洗膜后再加入辣根过氧化物（HRP）标记羊抗兔IgG（1∶1 000），室温孵育2 h。洗膜后用化学发光底物显影，凝胶图象处理系统软件分析目的条带的灰度值。以目的蛋白的灰度值与β-actin的灰度值的比值表示各目的蛋白相对表达水平，设对照组值为1，实验组与对照组比较，得出相对值，进行统计学分析。
1.3统计学处理
该实验重复3次，计量资料以x±s表示，采用SPSS 13.0软件分析处理实验所得数据，统计学方法采用t检验，P [10]Peng LT, Xu X. Ginsenoside Rh2 up-regulates caspase-3 and caspase-8 expression in human esophageal cancer cell line Eca-109[J].World Chinese Journal of Digestology,2010,18(36):3838-3842.
[11]Xue L, Ren L, Luo W, et al. Expression of Fas, Fas ligand, Fas-associated death domain protein, caspase 8 and mutant P53 protein in esophageal squamous cell carcinoma[J].Chinese Medical Journal,2007,87(3):150-154.
[12]Jingxuan Pan, Chao Cheng, Srdan Verstovsek. The BH3-mimetic GX15-070 induces autophagy, potentiates the cytotoxicity of carboplatin and 5-fluorouracil in esophageal carcinoma cells[J].Cancer Letters,2010,293: 167-174.
[13]Cui LL,Li CY,Wang Q,et al.Expression of EphrinB2 and Caspase-8 protein and mRNA in esophageal squamous cell carcinoma tissue[J].Journal of Zhengzhou University(Medical Sciences),2010,45(1):21-23.
[14]Zhang XF, Chen MH, Chen PP. Expression of Caspase-8 in human esophageal cancer tissues and its c linical significance[J].Shandong Medical Journal,2008,48(38):21-23.
[15]Mimori K, Ishii H, Inoue H, et al. Identification of the expression profile of apoptotic esophageal cancer cells by adenoviral-fragile histidine triad treatment[J].J Gastroenterol Hepatol,2008,23(2):S205-209.
（收稿日期：2011-05-09）
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