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【摘要】 目的 研究2型糖尿病(T2DM)患者血浆脂联素(APN)水平及脂联素基因启动子区-11377位点单核苷酸多态性(SNP)与糖尿病视网膜病变(DR)之间的关系。方法 运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术,对200例T2DM患者[无DR(NDR)组82例、非增殖型DR(NPDR)组72例、增殖型DR(PDR)组46例],检测APN基因启动子SNP-11377C→G多态性,同时检测血浆APN浓度、血脂、血糖、空腹胰岛素,比较各组基因型和等位基因频率,并分析各指标间的相关性。结果 ①APN水平随视网膜病变程度呈递增趋势 NDR、NPDR、PDR各分别为(6.11±2.77),(7.49±3.84),(9.83±4.97)mg/L,其中PDR组显著高于NDR和NPDR组(P0.05)。基因型(CC型、CG型和GG型)的血清APN水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论T2DM患者血APN水平随糖尿病视网膜病变进展而增高。未发现福建地区T2DM患者APN基因启动子区-11377C→G多态性与DR明显相关。
【关键词】
2型糖尿病;视网膜病变;脂联素;多态性;单核苷酸
Relationship between adiponectin and retinopathy in patients with type 2 diabetes mellitus
JIANG Hai-bin,LIN Jia-yu,SHI Ya-xiong,et al.Department of Endocrinology,The Second Hospital Affiliated to Fujian Medical University,Quanzhou 362000,China
【Abstract】 Objective To explore the association of adiponectin level,adiponectin gene-11377 polymorphism and diabetic retinopathy(DR)in patients with type 2 diabetes mellitus.Methods Adiponectin gene SNP-11377C→G was identified in 200 patients with type 2 diabetes mellitus,including 82 patients without retinopathy(NDR,n=82),72 patients with non-proliferative diabetic retinopathy(NPDR,n=72)and 46 patients with proliferative diabetic retinopathy(PDR,n=46),by polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP).Plasma adiponectin,blood lipid,fasting plasma glucose and fasting insulin serum were also measured,and compared with genotype and allele frequencies.Results Plasma adiponectin level showed an increasing tendency in groups of NDR,NPDR and PDR(6.11±2.77),(7.49±3.84),(9.83±4.97)mg/L.Plasma adiponectin level was significantly higher in PDR group than in NDR and NPDR groups(P0.05).Plasma adiponectin levels in three genotypes were not different(P>0.05).Conclusion Aggravation of diabetic retinopathy accompanied increasing adiponectin level in patients with type 2 diabetes mellitus.There was no significant association of SNP-11377C→G polymorphism in promoter region of adiponectin gene and diabetic retinopathy in patients with type 2 diabetes mellitus of Fujian.
【Key words】
Type 2 diabetes mellitus; Retinopathy; Adiponectin; Polymorphism; Single nucleotide
糖尿病视网膜病(DR)是糖尿病常见的微血管并发症之一,其主要病理变化是视网膜微血管结构和功能的改变。结构改变包括毛细血管基底膜增厚、毛细血管通透性增加、外周血细胞减少以及毛细血管微动脉瘤的形成。近年来,研究发现脂肪因子参与了2型糖尿病及其并发症的发生发展。脂联素是脂肪组织分泌的脂肪因子,具有改善胰岛素抵抗、拮抗动脉粥样硬化、负性调节免疫反应等作用,对糖尿病微血管病变尤其阻止糖尿病视网膜病变的发生发展,是否也具有保护效应,目前尚未明确。本研究旨在探讨血浆脂联素水平及APN基因启动子区-11377C→G多态性与T2DM视网膜病变发生发展之间的关系。
1 资料和方法
1.1 一般资料 按1999年世界卫生组织(WHO)制定的糖尿病诊断标准,选自本院内分泌科住院T2DM患者200例(男105例,女95例),排除心、肺、肝功能不全、糖尿病急性并发症、急性感染等疾病。按2001年国际临床糖尿病视网膜病变标准,根据眼底检查和眼底荧光血管造影结果分为3组:无DR(NDR)组82例(男44例,女38例),非增殖型DR(NPDR:微血管瘤,出血,硬性渗出,棉絮状软性渗出)组72例(男36例,女36例),增殖型DR(PDR:新生血管形成,玻璃体出血,机化物增生,继发性视网膜脱离,失明)组46例(男25例,女21例)。
1.2 检测方法 测量身高、体质量、腰围、臀围,计算体重指数(BMI)和腰臀比(WHR);测血压,检测糖化血红蛋白(HbA1C)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、血肌酐(Scr),计算低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和内生肌酐清除率(Ccr)。ELISA试剂盒测定血浆脂联素水平。体重指数(BMI)=体质量(kg)/身高(m�2);稳态模型评估的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=FPG×FINS/22.5。
脂联素基因多态性:提取全血DNA进行PCR扩增。从GenBank中查取人脂联素基因序列,用Primer3软件进行在线引物设计:上游引物5’-CTTTACTTTAAT GGTGGACTTG-3’,下游引物5’-CTAGAAGCAGCCTGGAGAA-3’。反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,57℃退火1 min,72℃延伸2 min,共35个循环;72℃终末延伸20 min。PCR产物以限制性内切酶Hha I在37℃水浴消化8 h后,行2%琼脂糖凝胶电泳,即得出该SNP的基因分型结果:只于347 bp处出现条带为CC型(无变异纯合子),于222 bp和125 bp两处出现条带者为GG型(变异纯合子),于347 bp、222 bp和125 bp三处出现条带者为CG 型(杂合子)。
1.3 统计学分析 计量资料以均值±标准差(x±s)表示,用SPSS 12.0统计软件包进行分析,计量资料组间比较用t检验,非正态分布的计量资料经对数转换后统计;计数资料组间比较用χ2检验。脂联素水平与临床指标的相关性,采用简单相关分析和偏相关分析。以Hardy-Weinberg平衡检验确定研究样本的群体代表性。
2 结果
2.1 NDR、NPDR、PDR各组临床资料比较,见表1。
APN在NDR、NPDR、PDR各组呈递增趋势(6.11±2.77),(7.49±3.84),(9.83±4.97)mg/L,其中PDR组显著高于NDR和NPDR组(P0.05),见表2。
2.4 各APN基因型观测指标的比较 CC、CG和GG 三组基因型的性别、年龄、病史、血压、血脂、血糖差异无统计学意义;APN水平差异无统计学意义(7.53±3.99),(7.28±3.96),(7.73±4.75),P>0.05)。
注:NDR:无糖尿病视网膜病变组;NPDR:非增殖型糖尿病视网膜病变组;PDR:增殖型糖尿病视网膜病变组;BMI:体质指数;WHR:腰臀比;SBP:收缩压;DBP:舒张压;1 mm Hg=0.133 kPa;TC:总胆固醇;TG:三酰甘油;LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇;HDL-C:高密度脂蛋白胆固醇;FPG:空腹血糖;FINS:空腹胰岛素;HOMA-IR:稳态模型胰岛素抵抗指数;HbA1C:糖化血红蛋白;Scr血肌酐;Ccr:肌酐清除率;APN:血浆脂联素;与NDR组比较,�*P[1]对2型糖尿病患者研究发现糖尿病视网膜病变与升高的血浆脂联素水平相关。Kato[2]也发现血浆脂联素水平与糖尿病视网膜病变的严重程度独立相关。Hadjadj[3]研究发现1型糖尿病患者血清脂联素水平、糖尿病病程与重度视网膜病变独立相关。Frystyk[4]对400例1 型糖尿病横断面调查研究则发现,PDR组血清脂联素水平显著高于NDR和NPDR组,而后二者无明显区别。本研究T2DM患者血浆脂联素水平在DR、NPDR、PDR各组呈递增趋势,PDR组显著高于NDR和NPDR组,与文献报道相似。
T2DM视网膜病变患者随着病程延长及病情进展,血脂联素逐渐升高。脂联素对DM大血管病变保护作用毋庸置疑,但是,也有实验研究发现脂联素具有刺激血管增生的特性[5],促进糖尿病视网膜病变发生发展。体外试验中脂联素可以作为化学诱导物刺激人静脉内皮细胞转化为具有毛细血管样结构的内皮细胞,体内试验时则可以刺激血管生长[6]。血脂联素与DR之间有密切关系。
T2DM视网膜病变患者脂联素水平异常增高的机制尚不清楚,可能是:①脂联素合成增多。脂联素有抗动脉粥样硬化的作用,通过抑制血管内皮细胞炎症及粘附;抑制巨噬细胞向泡沫细胞转化;抑制血管平滑肌细胞增殖;改善糖、脂代谢紊乱等与促炎和抗炎分子,补体分子,生长因子和信号传导蛋白,它们一起调节炎症,代谢和心血管事件[7,8]。本研究中,视网膜病变与病程具有相关性。随着病程进展,不仅糖尿病视网膜病变加重,心血管病变也加重,脂联素可能出现上调反应,代偿性合成增多;② 脂联素清除减少。T2DM视网膜病变患者可合并糖尿病肾病,脂联素水平的升高也可能与清除减少有关。Looker等[9]对T2DM肾病大量白蛋白尿患者分组,发现高血肌酐组脂联素水平显著高于低血肌酐组,血清脂联素水平与血肌酐呈正相关。本研究中脂联素水平与Ccr呈负相关,与血肌酐呈正相关,与文献报道一致。说明肾脏清除率下降也可能是脂联素水平升高的原因之一;③存在脂联素抵抗。脂联素能改善胰岛素抵抗,本研究也发现脂联素水平与HOMA-IR呈负相关,但随着视网膜病变加重,脂联素水平升高,没有体现明显的保护效应,HOMA-IR降低不显著,胰岛素抵抗并未继续改善,提示T2DM视网膜病变患者随着病情进展部分患者会出现脂联素抵抗,其机制可能涉及:①受体前:由于糖尿病患者胰岛素抵抗不断加重,具有显著保护效应的高分子量(HMW)脂联素减少,占总脂联素比例下降[10],虽然脂联素水平正常或升高,但生物活性下降;②受体部位:胰岛素抵抗和高糖环境使脂联素受体(AdipoR1和/或AdipoR2)表达减少11,12];③受体后:具有磷酸化作用的AMPK在高糖环境中活性下降,脂联素受体后下游信号转导障碍[13]。本研究的T2DM患者随病程延长,长期暴露在高糖环境,诱发脂联素抵抗。
关于脂联素基因SNP与糖尿病视网膜病变发生发展的相关性研究结论尚无肯定结论。Yoshioka等[14]在对696例糖尿病患者进行脂联素SNP94的研究中未发现脂联素SNP94基因型和等位基因的分布频率与糖尿病视网膜病变存在相关性。日本学者Yoshioka等[15]在对444名日本人进行脂联素SNP+276的研究中发现。脂联素SNP+276基因型和等位基因的分布频率在DR与NDR患者之间差异无统计学意义(P=0.63)。本研究组选取国内外研究较少的脂联素基因启动子5’侧翼区SNP-11377C→G,虽然前期报道该基因多态性与T2DM患者大血管病变CIMT有关,且独立于脂联素水平[16]与Patel等[17]最近的报道一致。但在本研究中未发现与福建地区T2DM患者视网膜病变的发生发展存在相关性。原因可能为:糖尿病性视网膜病变的发生与病程、代谢控制及遗传等多种因素综合有关,脂联素基因所起的作用可能被削弱。
总之,随着T2DM视网膜病变发生发展,血脂联素逐渐升高,可能存在脂联素抵抗,也可能是一种有益的代偿机制。高脂联素水平发挥保护作用,阻止糖尿病视网膜及肾脏病变进展,或是其自身参与了糖尿病微血管病变的发生发展,现在尚待研究阐明。脂联素及其基因多态性与糖尿病视网膜病变等微血管病变的相关性还有待更深入研究。
参 考 文 献
[1] B Zietz,C Buechler,K Kobuch,et al.Serum levels of adiponectiin are associated with diabetic retinopathy and with adiponectin gene mutations in Caucasian patients with diabetes mellitus type 2.Clin Endocrinol Diabetes,October 1,2008,116(9):532-536.
[2] K Kato,H Osawa,M Ochi,et al.Serum total and high molecular weight adiponectin levels are correlated with the severity of diabetic retinopathy and nephropathy.Clin Endocrinol(Oxf),March 1,2008,68(3):442-449.
[3] Hadjadj S,Aubert R,Fumeron F,et al.Increased plasma adiponectin concentrations are associated with microangiopathy in type 1 diabetic ubjects.Diabetologia,2005,48(6):1088-1092.
[4] Frystyk J,Tarnow L,Hansen TK,et al.Increased serum adiponectin levels in type 1 diabetic patients with microvascular complications.Diabetologia,2005,48(9):1911-1918.
[5] Shibata R,Ouchi N,Kihara S,et al.Adiponectin stimulates angiogenesis in response to tissue ischemia through stimulation of amp-activated protein kinase signaling.J Biol Chem,2004,279(27):28670-28674.
[6] Ouchi N,Kobayashi H,Kihara S,et al.Adiponectin stimulares angiogenesis by promoting cross-talk between AMP-activated protein kinase and Akt signaling in endothelial cells.Biol Chem,2004,279:1 304-1 309.
[7] Cai XJ,Li CJ,Chen L et al.A hypothesis:adiponectin mediates anti-atherosclerosis via adventitia-AMPK-iNOS pathway.Med Hypotheses,2008,70(5):1044-1047.
[8] Tsubakio Yamamoto K,Matsuura F,Koseki M et al.Adiponectin prevents atherosclerosis by increasing cholesterol efflux from macrophages.Biochem Biophys Res Commun,2008,375(3):390-394.
[9] Looker H,Krakoff J,Funahashi T,et al.Adiponectin concentrations are influenced by renal function and diabetes duration in Pima Indians with type 2 diabetes.J Clin Endocrinol Metab,2004,89:4010-4017.
[10] Wang Y,Lam K,Chan L,et al.Post-translational modifications of the four conserved lysine residues within the collagenous domain of adiponectin are required for the formation of its high molecular weight oligomeric complex.J Biol Chem,2006,281:16391-16400.
[11] Lin H,Kim J,Pocai A,et al.Adiponectin resistance exacerbates insulin resistance in insulin receptor transgenic/knockout mice.Diabetes.2007,56:1969-1976.
[12] Barnea M,Shamay A,Stark A,et al.A high-fat diet has a tissue-specific effect on adiponectin and related enzyme expression.Obesity.2006,14:2145-2153.
[13] Cammisotto P,Londono I,Gingras D,et al.Control of glycogen synthace through AdipoR1-AMPK pathway in renal distal tubules of normal and diabetic rats.Am J Physiol Renal Physiol,2008,294:F881-F889.
[14] G Rudofsky Jr,M Schlimme,A Schlotterer,et al.No association of the 94T/G polymorphism in the adiponectin gene with diabetic complications. Diabetes Obes Metab,July 1,2005;7(4):455-459.
[15] Yoshioka T.Yoshida Y,Takakura.et al.Adiponectin gene polymorphism(G276T)and diabetic retinopathy in Japanese patients with Type 2 diabetes.Diabetic Med,2004,21(10):1158-1159.
[16] 蔡清颜,施亚雄,李永加,等.福建地区T2DM患者脂联素基因启动子区多态性与颈动脉内膜中层厚度有关.中华内分泌代谢杂志,2009,25:136-138.
[17] Patel S,Flyvbjerg A,Kozàkovà M,et al.Variation in the ADIPOQ gene promoter is associated with carotid intima media thickness independent of plasma adiponectin levels in healthy subjects.European Heart Journal,2008,29(3):386-393.
