【www.zhangdahai.com--班主任工作总结】
Cigarette Smoke Cause Oxidative Stress on Human Bronchial Epithelial Cells ZHOU WenquLI BingHONG Wei
Experiment Medical Research Center,Guangzhou Medical College,Guangzhou 510000,China
[Abstract] Objective Observe if cigarette smoke which can be inhaled and deposit in respiratory tract caused oxidative stress on human bronchial epithelial cells. Methods Burning a well-known brand cigarette in a huge glass box,when cigarette smoke form, collected the smoke with a six stage,FA-1-type cascade impactor,got six different sizes particles of cigarette smoke,add different sizes particles of cigarette smoke to human bronchial epithelial cells(16HBE). Detecting reactive oxygen in 16HBE cells by fluorescence probe 6 hours later. Results Cigarette smoke particles obviously increased reactive oxygen in human bronchial epithelial cells compare with no cigarette smoke stimulated group.In different size Cigarette smoke particles, cigarette smoke particles at fourth stage(2.1～3.3μm) caused more oxidative stress in six stages. Cigarette smoke particles at sixth stage(0.65～1.1μm) directly damage human bronchial epithelial cells. Conclusion Cigarette smoke which can be inhaled and deposit in respiratory tract cause oxidative damage on human bronchial epithelial cells and can also cause direct damage on human bronchial epithelial cells.
[Key words] Cigarette smoke;Particle;Oxidative stress
[摘要] 目的 观察香烟形成的可吸入并沉积在呼吸道的香烟烟雾是否对人支气管上皮细胞造成的氧化应激。方法 用FA-1型多级撞击式空气采样器对形成的烟雾进行采样,收集到6种大小不同的香烟烟雾颗粒,将采得的不同大小的香烟烟雾颗粒分别对人支气管上皮细胞(16HBE)进行刺激。6h后用荧光探针检测16HBE细胞中的活性氧。结果 与未加香烟烟雾颗粒刺激对照组比较,香烟烟雾颗粒明显造成人支气管上皮细胞中活性氧增加。不同大小香烟烟雾颗粒中,第四级(2.1～3.3μm)的香烟烟雾颗粒造成的氧化应激最明显。第六级(0.65～1.1μm)大小的颗粒能直接对人支气管上皮细胞造成损伤。结论 可吸入并沉积在呼吸道中的香烟烟雾能造成呼吸道上皮细胞的氧化损伤。也能对呼吸道上皮细胞造成直接损伤。
[关键词] 香烟烟雾;颗粒;氧化应激
[中图分类号] R361.3[文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)06-24-02
香烟是导致慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肺癌等疾病的主要元凶之一[1],香烟中含有4700多种化学物质,包括多种氧化剂、自中基及半醌基,这些化学物质打破了机体氧化抗氧化的平衡并能在肺中导致细胞内的损伤,首当其冲受损的是气道上皮细胞[3]。
香烟燃烧后的香烟烟雾是以气溶胶形式存在空气中,气溶胶是空气中悬浮的固态或液态颗粒的总称,5～10μm直径大小的气溶胶颗粒能在空气中停留较长时间,进入人的呼吸系统[4]。通过FA-1型空气采样器能收集能进入并沉积在呼吸道的香烟颗粒,通过荧光探针检测细胞内的活性氧,观察香烟烟雾颗粒对支气管上皮细胞的氧化作用。
1材料与方法
1.1材料
主要仪器有FA-1型多级撞击式空气采样器(辽阳市康洁仪器研究所),LEICA DM IRBE倒置荧光生物显微镜,钢化玻璃箱(容积为100cm×50cm×50cm,内置紫外灯)。所用香烟为国内知名品牌“大前门”香烟。主要试剂DMEM细胞培养基,荧光素5-(and-6)-carboxy-2",7"-dichlorodihydrofluorescein diacetate(carboxy-H2DCFDA)均购自invitation公司。细胞培养皿为corning公司。
1.2方法
1.2.1采样将6个含有3mL DMEM培养液的100mm×20mm大小的细胞培养皿依次放入FA-1型多级撞击式空气采样器中,将空气采样器置于250L钢化玻璃箱内,箱内空气紫外线消毒30min,通气1h后燃烧1支香烟。待烟雾扩散后,启动采样器,各级采集样品,采样流量为28.3L/min,采样时间为9min。香烟烟雾颗粒被采集到采样器内6个平皿中的DMEM培养基中。采样器收集到的6级颗粒由第1级至第6级大小分别为>7.0m,4.7～7.0μm,3.3～4.7μm,2.1～3.3μm,1.1～2.1μm 以及0.65～1.1μm。
1.2.2细胞刺激将收集到香烟气溶胶颗粒的6个平皿中的DMEM培养基分别加入铺满人支气管上皮细胞16HBE的3个6孔板中,每个平皿中的3mL DMEM培养基加入3个平行孔各1mL。同是另一铺满细胞的6孔板中加入无香烟颗粒的DMEM培养基作为阴性对照,将6孔板置于温度37℃、5%CO2浓度的培养箱中,6h后取出,倾去培养液,HBSS液洗两遍,用含5μmol carboxy-H2DCFDA的HBSS液37℃处理40min。然后用HBSS液洗3遍,每孔加入1mL DMEM培养基于荧光倒置显微镜下观察。本实验重复3次。
2结果
2.1颗粒分布
收集到的6种大小香烟颗粒的含DMEM平皿中,第6级收集到的可见香烟颗粒最多(0.65～1.1μm),第5级收集到的可见颗粒(1.1～2.1μm)则其次。其他级别未见明显可见颗粒。
2.2细胞形态
在阴性对照的孔板中,光镜下支气管上皮细胞形态完好,死亡细胞很少,在加入1～5级香烟颗粒的孔板中,细胞形态变化不大,死亡细胞液比较少,在加入第6级香烟颗粒的孔板中,由于该级别收到的颗粒较多,有较多细胞死亡。在荧光显微镜下可见许多死细胞产生的背景荧光。
2.3细胞内活性氧观察
在阴性对照的孔板中,几乎观察不到绿色荧光,细胞氧化应激非常低,与阴性对照比较,如封三图7所见。加入多级空气采样器收集到6种大小香烟烟雾颗粒的DMEM的孔板中,荧光显微镜下各级均能观察到H2DCFDA进入细胞后能氧化分解为DCF显示的绿色荧光,尤以第4级(2.1～3.3μm)绿色荧光最强。第3级(3.3～4.7μm)。其次,第6级(0.7～1.1μm)中有许多死细胞产生的背景荧光。
3讨论
吸烟与呼吸系统多种肿瘤和疾病发生有一定关联,但至今人们对吸烟的致病机制仍不是很清楚。氧化应激导致的损伤被认为可能是香烟引起呼吸系统疾病的重要因素,以往研究者进行香烟烟雾研究时,直接收集所有烟雾,并将>0.22μm颗粒物过滤掉[5-7],因而忽略香烟烟雾中固体颗粒物对呼吸系统的影响。香烟烟雾中既有固体成分,也有液体成分,本实验创新性地采用空气收集器对烟雾进行全面收集。极大颗粒的烟雾将向地面下沉,极小颗粒吸入呼吸道后将呼出呼吸道,只有大小合适的烟雾才可以被吸入并沉积在呼吸道中,对人的呼吸道造成损伤,本研究中采用的国际通用类似安德森采样器的空气采集器是一种分级采集方式,即利用碰撞采样器把不同粒度的气溶胶分别采集在不同的容器上[8],只对可沉积在人呼吸道的香烟烟雾颗粒进行分大小收集,并将其对人支气管上皮细胞进行刺激。结果发现,第6级(0.7～1.1μm)和第5级(1.1～2.1μm)收集到得可见颗粒较多,说明香烟烟雾中的可沉积在呼吸道内的固体成分集中在0.7～2.1μm大小,其他级别未见明显可见颗粒,但烟味很浓,可能以焦油等液体成分为主。实验中收集到的各级香烟烟雾的颗粒均可对人支气管上皮细胞造成氧化刺激,收集器1~3级是大部分进入上呼吸道的香烟烟雾,4～6级大部分是则进入下呼吸道的香烟烟雾,从实验结果可以看出,第4级(2.1～3.3μm)颗粒大小的香烟颗粒造成的氧化应激更为严重,香烟中的氧化剂可进一步促使吸烟者炎症细胞如中性粒细胞和巨噬细胞迁移入肺内并释放氧自由基。对肺造成进一步损伤[9]。第6级(0.7～1.1μm)收集到的香烟烟雾可见颗粒最多,不但对人支气管上皮细胞造成氧化应激,而且直接造成了严重损伤,导致大量细胞死亡,死亡的细胞发出黄绿色荧光,与DCF所发荧光相比较暗,可见除香烟提取物可造成氧化应激以及细胞造成损伤外,香烟颗粒对细胞可以产生直接的损伤,以往研究均以香烟烟雾提取物进行实验忽略了香烟颗粒对气道产生的直接损伤,但从本实验结果看,颗粒物造成的直接损伤也在香烟对呼吸道上皮细胞的伤害中起着重要作用。香烟烟雾颗粒物对呼吸道的直接和间接损伤使得香烟烟雾对下呼吸道的损伤更为严重,吸烟被认为是慢性阻塞性肺疾病(COPD)发病的重要因素,小气道阻塞常见于COPD患者,香烟烟雾对小气道的损害应该是COPD发病的重要原因之一。香烟烟雾对气道损伤反应的深入研究有助于进一步认识呼吸道疾病的发生发展,以便更好地对疾病治疗和预防,也为我们以后研究香烟的致病机制提供了依据。
[参考文献]
[1] Church DF,Pryor WA. Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications[J]. Environ Health Perspect,1985,64:111 -126.
[2] Kirkham P, Rahman I. Oxidative stress in asthma and COPD:Antioxidants as a therapeutic strategy[J]. Pharmacol Ther,2006,111:476-494.
[3] Rahman I,Biswas SK,Kode A. Oxidant and antioxidant balance in the airways and airway diseases[J]. Eur J Pharmacol,2006,533:222- 239.
[4] Nicas M,Nazaroff W,Hubbard A. Toward understanding the risk of secondary airborne infection: emission of respirable pathogens[J]. J Occup Environyg,2005,2:143-154.
[5] Luppi F,Aarbiou J,van Wetering S,et al. Effects of cigarette smoke condensate on proliferation and wound closure of bronchial epithelial cells in vitro:role of glutathione[J]. Respir Res,2005,6:140.
[6] Aruna Kode,Se-Ran Yang and Irfan Rahman. Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airwayepithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells[J]. Respir Res,2006,7:132.
[7] 付强,成静,韩中博,等. 香烟烟雾提取物对人呼吸道上皮细胞DNA损伤和凋亡的影响[J]. 癌症,2006,25(10):1191-1197.
[8] Yabuki S,Kanayama S,Fu F,et a1. Aeolian Dust Experiment on Climate Impact. Physical and Chemical Characteristics of Aeolian Dust Collected Over Asian Dust Source Regions in China-Comparison with Atmospheric Aerosols in an Urban Area at Wako, Japan[J]. Journal of Arid Land Studies,2002,11:273-289.
[9] Morrison D, Rahman I, Lannan S,et al. Epithelial permeability,inflammation,and oxidant stress in the air spaces of smokers[J]. Am J Respir Critare,1999,159:473-479.
(收稿日期:2009-11-30)
