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[摘要]目的：研究不同配方及浓度的胰蛋白酶对人瘢痕角质形成细胞（Keratinocyte，K）生物活性影响。探索一种更适于瘢痕角质形成细胞原代培养消化的方法。方法：温消化法分离瘢痕组织表皮、真皮后，分别采用0.1%胰蛋白酶和0.05%胰蛋白酶-0.025%EDTA对表皮片进行消化，培养角质形成细胞，用台盼蓝染色法和24h细胞贴壁率观察K存活率及细胞活性。结果：两种配方胰酶消化K，细胞存活率均达80%以上，结果无统计学差异(P＞0.05)。与单独使用胰蛋白酶相比，经胰蛋白酶-EDTA组消化后的细胞贴壁率增加，结果有统计学差异(P＜0.05)。结论：胰蛋白酶-EDTA能较温和地消化角质形成细胞，较大程度地保留细胞活性，与胰蛋白酶消化法相比，此方法更适合K的消化及培养。
[关键词]角质形成细胞；胰蛋白酶；乙二胺四乙酸
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）05-0762-02
Effect of different digestion methods on the hypertrophic scar derived keratinocytes culture
JIANG Cai-li,NONG Xiao-lin
(Department of Oral and Maxillofacial Surgery,College of Stomatology,Guangxi Medical University,Nanning 530021,Guangxi,China)
Abstract: Objective To research the effect of different digestion methods acted on keratinocytes and obtain a better one. Methods Cultured keratinocytes derived from hypertrophic scar using digestion 0.1% trypase and 0．05% trypase with 0.025% ethlenediamine tetracetic acid (EDTA)．Cell vigor was observed with teypane blue stained and calculated the adherence rate in 24 hours. Results Keratinocytes digested by different trypase showed over 80%survival rate．However,a significant difference was found on adherence rate in 24 hours (P＜0.05). Conclusion Digestion with 0．05% trypase mixed 0. 025% EDTA was better for cultivation of keratinocyte compared with 0.1%trypase using alone.
Key words:Keratinocyte；Trypase；EDTA
在瘢痕研究中，笔者比较了两种不同的消化酶在培养原代瘢痕角质形成细胞时的效果，报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂：胰蛋白酶、DMEM、角质形成细胞无血清培养基（K-SFM）、含100U／ml青霉素、100 mg／ml链霉素双抗，购自Gibco公司。胎牛血清（FCS），购自Hyclone公司。乙二胺四乙酸（EDTA），购自Sigma公司。DispaseⅡ，购自ROCHE公司。台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒（购自BOSTER公司）。
1.2 标本来源：均来自于广西医科大学整形外科行瘢痕整复术的患者，取材局部未使用瘢痕抑制药物，不伴有肿瘤或其他严重疾病。取材前经患者知情同意。
1.3 实验方法
1.3.1 瘢痕角质形成细胞的分离与培养：手术切除的瘢痕标本保存于含有500U/ml青霉素和500mg/ml链霉素的PBS中，4℃无菌条件下运送到超净工作台，取出标本，75%酒精浸泡30s，以含100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的PBS反复漂洗5次，剪弃皮下脂肪及结缔组织。将皮肤瘢痕修剪为3mm×20mm长条状，移入DispaseⅡ(2.4U/ml)中，37℃ 3h。从瘢痕组织中剥离表皮片，分别放入含0.1%胰蛋白酶的PBS消化液中，37℃培养箱中10min，轻柔吹打5min，和已预热至37℃含0.05%胰蛋白酶-0.025%EDTA的PBS消化液中，轻柔吹打5min。加入等体积含10%FCS的DMEM培养液中止消化，200目不锈钢筛网过滤，1 000rpm离心10min，弃上清收集细胞，培养基洗脱两次，以K-SFM重悬沉淀成均匀细胞悬液。实验分为：0.1%胰蛋白酶消化组和0.05%胰蛋白酶-0.025%EDTA消化组，每组设5个副孔比较。
1.3.2 台盼蓝染色检测细胞存活率：收集细胞悬液，离心1 000rpm，1min，以细胞稀释液调整细胞密度为1×106/ml，重悬细胞，将100μl细胞悬液和100μl 0.4%台盼蓝染色液轻轻吹打混匀，3min后滴板计数500个细胞，未着色者为活细胞，着蓝色者为死细胞。计算方法：细胞存活率（%）＝活细胞数/500×100% 。
1.3.3 细胞贴壁率：取细胞悬液，调整细胞密度为1×104/ml,接种入24孔板，每孔1ml，置于37℃ 5% CO2培养箱中，24h后取出，弃培养液。每孔加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 0.5ml，37℃温箱中消化5～10min，以等量含10%FCS的DMEM培养液终止消化。1 000rpm离心10min，加入K-SFM混悬细胞，取细胞悬液计数。贴壁率（%)=（贴壁细胞数/接种细胞数)×100%。
1.3.4 统计学处理：统计学分析采用统计软件SPSS 13.0，样本率的比较采用χ2检验。
2 结果
2.1 采用胰蛋白酶和胰蛋白酶-EDTA，消化角质形成细胞，镜下观察细胞呈圆形，大小相似，轮廓清晰，胞浆透亮，胞核较大而清晰。台盼蓝染色活细胞计数均�80%（见表1），两组胰酶对角质形成细胞活力的影响无统计学意义（P�0.05）。
2.2 角质形成细胞以K-SFM作为培养基，置于37℃5%CO2培养箱中培养。胰蛋白酶消化组细胞培养6h见少量细胞贴壁，10h后贴壁细胞稍有增加，24h后仍有60%的细胞未贴壁，贴壁后细胞由圆形变为不规则多角形，细胞边界尚清，胞浆内可见少量空泡和较多颗粒，细胞活性较差。胰蛋白酶-EDTA消化组细胞培养4h则可见较多细胞贴壁，8h后50%的细胞都已贴壁，24h后贴壁细胞超过70%。贴壁后细胞很快变为不规则多角形，轮廓清晰，胞浆清亮，呈现活跃的生长态势（见表2）。不同配方及浓度胰酶消化角质形成细胞，对细胞贴壁率的差异有统计学意义（P＜0.05）。
3 讨论
从皮肤结构方面，真表皮连接包括基底层角质形成细胞基底面借半桥粒与基底膜连接，而相邻角质形成细胞间为桥粒连接。目前，在角质形成细胞的原代培养中，分离表、真皮通常使用胰蛋白酶或中性蛋白酶[1]。胰蛋白酶是胰酶的一种，通过水解细胞间的蛋白质为多肽，而使细胞离散，这种分散细胞的特性依据其作用的组织和细胞、浓度、温度及时间的不同而改变，消化过度往往造成细胞损伤。中性蛋白酶DispaseⅡ主要分解Ⅳ型胶原和纤维粘连蛋白[2]，选择性地作用于半桥粒，使真、表皮间的连接松散，易于分离，对细胞不造成损伤。胰蛋白酶短时间的作用于角质形成细胞，不至于使其死亡，因此，细胞的存活率较高。胰蛋白酶能从蛋白质上去除带正电荷的氨基酸，而细胞的贴壁率与其表面所携带的电荷是有关的。EDTA是2价阳离子螯合剂，能螯合钙离子，而角质形成细胞间连接所需的桥粒的形成依赖于钙离子的存在。因此，胰蛋白酶与EDTA的联合使用，可以破坏细胞的桥粒结构，解除细胞的接触抑制，使细胞分散成单个细胞，明显提高角质形成细胞的增殖能力，同时减少了胰蛋白酶的作用浓度和时间，间接地增加了细胞贴壁率，提高了角质形成细胞原代培养的成功率。此外，GIBCO公司近年研发的角质形成细胞无血清培养液(K-SFM)添加促角质形成细胞生长的物质，有利于细胞的贴壁、增殖[3-4]，同时最大限度的限制了成纤维细胞的生长，不失为一种简便易行，安全适用的理想方法。由于个体及损伤因素的不确定性，瘢痕组织的表现形态及组织特点也具有差异性（如患者年龄、瘢痕形成时间、程度等），仍然需要根据实验的具体情况作出相应的调整。
[参考文献]
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[收稿日期]2012-01-11 [修回日期]2012-03-15
编辑/张惠娟
