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[摘要] 目的：探讨甘肃地区回族及汉族人群醛糖还原酶基因启动子区C（-106）T多态性与糖尿病视网膜病的关系以及该多态性在两民族间的差异。方法：应用PCR-RFLP技术检测81例汉族2型糖尿病患者和83例健康汉族对照者ALR的基因型，分别以氧化酶法、放免法、比色法测定空腹血糖、空腹胰岛素、糖化血红蛋白水平。结果：①ALR基因C（-106）T多态各基因型及等位基因分布频率在对照组和2型糖尿病组间差异无统计学意义；糖尿病视网膜病组CT/TT基因型及T等位基因频率较无糖尿病视网膜病组均高，但差异无统计学意义；糖尿病视网膜病组T等位基因及CT/TT基因型分布频率明显高于正常对照组，差异有统计学意义。相对危险度分析发现，CT/TT基因型患糖尿病视网膜病的风险是CC基因型的2.127倍；携带T等位基因患糖尿病视网膜病的风险是C等位基因的1.962倍。②在回、汉两民族2型糖尿病患者中进行比较，回族CT/TT基因型及T等位基因均高于汉族，但是差异无统计学意义。结论：在甘肃地区回、汉两民族人群中都存在ALR基因启动子区C（-106）T多态性，且该位点多态性在两民族间无显著性差异。CT/TT基因型和T等位基因可能与回、汉两民族糖尿病视网膜病的发生相关。
[关键词] 醛糖还原酶；基因多态性；糖尿病视网膜病；多态性
[中图分类号] R587.1 [文献标识码]A[文章编号]1674-4721（2011）05（c）-030-03
The difference of C(-106)T polymorphism of the Aldose Reductase gene between diabetic retinopathy in Han and Hui population
YIN Hong, ZHANG Yingli, XIN Yan, CHEN Huaqin, PU Huali
Department of Endocrinology, the First People′s Hospital ofLanzhou City, Gansu Province, Lanzhou 730050, China
[Abstract] Objective: To investigate the Aldose Reductase gene polymorphism in Han population and Hui population in Gansu province and its association withtype 2 diabetes mellitus (T2DM). Methods: Genotype of Aldose Reductase was determined in patients with type 2 DM and healthy controls by PCR- RFLP. Plasma glucose, insulin and HbA1c levels were measured by biochemical technique. Results: ①There were no significant differences in genotypic or allelic distribution in patients with or without type 2 diabetic mellitus in Han population；The frequencies of T allele and CT/TT genotype of the ALR gene in dianbetic retinopathy group was higher than the group without diabetic retinopathy,but there were no significant differences; There were significant difference in frequencies of T allele and CT/TT genotype between DR group and control group, the relative risk of CT/TT genotype and T allele suffered from DR were 2.127 times and 1.962 times of the CC genotype respectively. ②There were no significant differences in genotypic or allelic distribution in T2DM patients between Han and Hui populations. Conclusion: A polymorphism C(-106)T at 5′regulatory region of Aldose Reductase gene is found both in Han and Hui populations in Gan Su province, and no difference between two groups for frequency of CC, CT, TT genotypes and C, T allele. The T allele and CT/TT genotype of the ALR gene might be a genetic marker of susceptibility to diabetic retinopathy.
[Key words] Aldose Reductase; Polymorphism; Diabetic Retinopathy; Polymorphism
醛糖还原酶（aldose reductase，ALR）是多元醇通路的限速酶，该酶基因表达异常会影响糖尿病微血管并发症的发生发展。近年来，ALR基因被列为糖尿病微血管病的候选基因之一。糖尿病视网膜病是目前失明的主要原因，其发生与遗传也有密切的关系。该研究旨在探讨甘肃汉族人群ALR基因启动子区C（-106）T多态性与2型糖尿病视网膜病的相关性以及该位点多态性在回、汉两民族间的差异。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2型糖尿病组：随机选取2007年1月～2009年1月甘肃省人民医院内分泌科的住院患者，共81例，男42例，女39例，年龄 40～71岁， 按照1997年美国糖尿病协会（ADA）的诊断标准：症状+随机血糖≥11.1 mmol/L，或FPG≥7.0 mmol/L，或OGTT中2HPG≥11.1 mmol/L，糖尿病病程10年以上。以上患者彼此间无血缘关系，并排除重度吸烟（>10支/d）、嗜酒者，排除原发性性腺、甲状腺、甲状旁腺、垂体疾病及肾功能损害、酮症等急性并发症。DR诊断按1985年全国眼底病学组制定的标准，根据眼底摄像检查和眼底荧光素血管造影结果分以下亚组：糖尿病视网膜病变组（diabetic retinopathy，DR）46例，糖尿病病程（14.0±4.1）年；无视网膜病变组（NDR）35例，糖尿病病程平均（12.5±3.7）年，眼底检查正常。高血压的诊断符合1999年世界卫生组织（WHO）的诊断标准。全部研究对象均来自甘肃地区汉族人群，且无血缘关系。①对每位患者询问病史，测量身高及体重，计算体重指数（BMI）＝体重/身高2（kg/m2）。②抽空腹静脉血分别用氧化酶法和放免法测定血糖（FPG）、血胰岛素（FINS）、用比色法测糖化血红蛋白（HbA1c）。
正常对照组（CON）：共 83例，男42例， 女41例，年龄40～70岁，以上均为健康体检者，无糖尿病及其他自身免疫性疾病。
1.2 实验方法
1.2.1 引物设计与合成根据Genebank提供的ALR的基因序列应用Primer Premier引物设计软件自行设计了引物(由宝生物工程有限公司合成)，序列为上游引物为：5′GAATCTTAACATGCTTAG 3′，下游引物为：5′GCCCAGCCCTATACCTAC 3′，特异性扩增ALR基因包含启动子区C（-106）T多态的一段376 bp的DNA序列。
1.2.2 人类基因组DNA提取采用柱式DNA提取试剂盒 (购自上海生工生物工程有限公司) ，按照说明书的步骤进行提取，提取后的基因组DNA，-20℃保存备用。
1.2.3 PCR扩增反应体系为25 μl，其中包括10×PCR buffer 2.5 μl， dNTP mixture 2.5 μl， TaqDNA聚合酶2 μl(0.5 U/μl)，特异性引物各1.5 μl（2 pmol/μl），模板DNA 2 μl， MgCl2 1.5 μl（10 mmol/μl），不足体积用灭菌双蒸水补足至25 μl。置PCR 2400热循环仪（美国应用生物公司生产），94℃预变性5 min，再按下列程序循环34次，即94℃变性45 s，59℃退火45 s，72℃延伸45 s；末次循环后，72℃延伸10 min。
1.2.4 扩增产物的限制性酶切取PCR扩增产物10 μl，用限制性内切酶XspⅠ10 U（购自大连宝生物工程有限公司）酶切，37℃孵育4 h，反应终止后，消化片段在2%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭（EB）染色，染色后通过法国VL凝胶成像系统判断结果。
1.2.5 血糖、血胰岛素、糖化血红蛋白水平测定氧化酶法测定血糖、放免法测定血胰岛素、比色法测定糖化血红蛋白。HOMA胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=FPG×FINS/22.5。
1.3 统计学处理
应用拟合优度χ2检验ALR基因型频率是否符合Hardy-Weinberg（H-W）遗传平衡定律。非正态分布变量，用自然对数转换成正态分布，取其自然对数进行统计，在数值表达式中还原成原值。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用ANOVA检验，基因型频率以及等位基因频率的比较采用χ2检验。P [参考文献]
[1]尹虹,张莹丽,陈华琴,等.醛糖还原酶基因启动子区C(-106)T多态性与2型糖尿病视网膜病的相关性[J].中华临床医师杂志,2010,4(10):1881-1884.
[2]Kao YL,Donaghue K,Chan A,et al.A novel polymorphism in the aldose reductase gene promoter region is strongly associated with diabetic retinopathy in adolescents with type 1 diabetes[J].Diabetes,1999,48(1):1338-1340.
[3]Gosek K,Moczulski D,Zukowska-Szczechowska E.C-106T polymorphism in promoter of aldose reductase gene is a risk factor for diabetic nephropathy in type 2 diabetes patients with poor glycaemic control[J].Nephron Exp Nephrol Epub,2005,99(3):63-67.
[4]Santos KG,Canani LH,Gross JL.The -106CC genotype of the aldose reductase gene is associated with an increased risk of proliferative diabetic retinopathy in Caucasian-Brazilians with type 2 diabetes[J].Mol Genet Metab,2006,88(3):280-284.
[5]Demaine A,Cross D,Millward A.Polymorphisms of the aldose reductase gene and susceptibility to retinopathy in type 1 diabetes mellitus[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2000,41(10):4064-4068.
[6]Li Q, Xie P,Huang J,et al.Polymorphisms and functions of the aldose reductase gene 5’ regulatory region in Chinese patients with type 2 diabetes mellitus[J].Chin Med J,2002,115(2):209-213.
[7] Wang Y,MD,CHB.Phenotypic heterogeneity and associations of two aldose reductase gene polymorphisms with nephropathy and retinopathy in type 2 diabetes[J].Diabetes Care,2003,26(8):2410-2415.
（收稿日期：2011-04-12）
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