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【摘要】 目的 探讨辛伐他汀和阿仑磷酸钠对体外培养成骨细胞的影响。方法 分离3周龄成骨细胞，体外培养时以辛伐他汀和阿仑磷酸钠刺激，观察成骨细胞碱性磷酸酶水平和成骨细胞增殖率。结果 辛伐他汀、阿仑磷酸钠可以促进成骨细胞增殖，增加碱性磷酸酶的分泌，二者共同作用后作用更显著。结论 辛伐他汀和阿仑磷酸钠能促进成骨细胞增殖和分泌碱性磷酸酶，可以联合作用促进骨形成。�
【关键词】辛伐他汀；阿仑磷酸钠；成骨细胞��
Effect of alendronate sodium and simvastatin on osteoblasts cultured in vitro
CUI Wei-ding,LI Yu-ming,WEI Xin-cheng.
Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Jiangsu211166，China
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【Abstract】 Objective To study the effect of alendronate sodium and simvastatin on osteoblasts cultured in vitro． Methods Three weeks old SD rats osteoblasts were isolated, osteoblasts were stimulated with alendronate and simvastatin, proliferation ratio and alkaline phosphatase (ALP)activity were assessed． Results Alendronate sodium and simvastatin not only promoted proliferation of osteoblasts， but also stimulatedALPactivity, combination of both drugs had a significant effect． Conclusion Alendronate sodium and simvastatin can promote proliferation and ALP activity of osteoblasts, which could be combinated to promote the form of bone．�
【Key words】Simvastatin；Alendronate sodium；Osteoblast
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骨质疏松症已成为威胁老年人的多发病，阿仑磷酸钠是治疗骨质疏松的常见药物，主要作用机制是抑制破骨细胞的骨吸收，降低骨转换率。辛伐他汀主要用来治疗高脂血症，两种药物都通过抑制胆固醇代谢中的甲羟戊酸途径发挥作用，因此学者们发现辛伐他汀对骨代谢也有一定的影响。阿仑磷酸钠和辛伐他汀联合作用如何影响成骨细胞呢。本实验中笔者观察阿仑磷酸钠和辛伐他汀对体外培养成骨细胞的影响，进一步探索两种药物对骨代谢的作用。�
1 材料与方法�
1．1 材料 3周龄SD大鼠（南京医科大学实验动物中心），DMEM-F12培养基、胎牛血清（美国Hyclone公司），HEPES、谷氨酰胺、阿仑磷酸钠、辛伐他汀（美国Sigma公司），CO2培养箱（LB-7，日本池本理化工业株式会社），胰蛋白酶、MTT（美国Sigma公司）。�
1．2 成骨细胞的培养 无菌条件下取大鼠颅盖骨，剪碎至1 mm3 大小，用PBS液充分冲洗。先后用0．25%胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化，离心去上清，沉淀的细胞加入含15％胎牛血清的DMEM-F12培养液，吹打成细胞悬液。细胞计数板计数，调整细胞浓度为1×105 /ml，接种于25 cm2培养瓶，37℃、5％ CO2饱和湿度的孵箱内培养，换液1次/3 d，当细胞在培养瓶中生长汇合后传代。�
1．3 碱性磷酸酶染色 将二代成骨细胞计数，以1×10�4/孔的密度接种于6孔培养板，DMEM-F12培养液培养。经过4 d左右，细胞生长接近铺满培养板底部后，吸去培养液，用PBS缓冲液冲洗，以95％无水酒精固定10 min。吸去固定液，三蒸水冲洗3遍，每孔迅速加入2 μl 1×AP反应缓冲液、100 μl NBT（nitro blue tetrazolium）溶液和50 μl BCIP（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate）溶液，混匀，室温下放置30 min，PBS漂洗数次。晾干后镜下观察，-20℃保存。�
1．4 药物对成骨细胞增值率的影响 将二代成骨细胞以密度为5×103/孔接种于96孔培养板上。待其贴壁后，小心吸去培养液，将含各种浓度阿仑磷酸钠和辛伐他汀的DMEM-F12培养液0．2 ml加入到培养板，浓度分别为阿仑磷酸钠 1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9 mol/L和辛伐他汀1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9 mol/L组，DMEM-F12为阴性对照组，每组6个孔。放于孵箱培养72 h，各孔加入MTT液，20 μl/孔，轻轻吹打，继续培养4 h。吸出孔内培养液后，加入DMSO液150 μl/孔，室温下将培养板置于微孔板震荡器震荡10 min，使结晶溶解。酶标仪检测各孔OD值，检测波长570 nm， 参考波长630 nm，检测阿仑磷酸钠和辛伐他汀对成骨细胞增值率的影响。以两种药物增殖率最高的浓度混合后检测两者共同作用的的影响。�
1．5 药物对成骨细胞碱性磷酸酶的影响 将二代成骨细胞以密度5×103/孔接种于96孔培养板，培养24 h后细胞完全贴壁，吸去培养液。将培养板分组，每组6个孔，将含阿仑磷酸钠和辛伐他汀各种浓度的DMEM-F12培养液0．2 ml加到培养板，浓度同前一步骤，DMEM-F12培养液为阴性对照组，共10组。培养72 h后，将1 ml反应液R1加到比色杯中，37℃孵育3 min后加入20 μl各待检测孔上清液，搅匀并保温30 s。加入250 μl反应液R2到比色杯中，搅匀并保温30 s，然后用分光光度计测定405 nm处2 min内的吸光度变化，间接得出ALP活性值（U/L）。以两种药物ALP活性最高的浓度混合后再观察两者共同作用的影响。�
1．6 统计学方法 实验数据采用SPSS 13．0统计软件包分析，各组测得MTT的吸光度和ALP活性的实验数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，P值
2．2 药物对成骨细胞增殖率的影响 1×10-8、1×10-9 mol/L的阿仑磷酸钠明显促进成骨细胞的增殖(P-7 mol/L的浓度作用更强(P-6 mol/L的阿仑磷酸钠抑制成骨细胞的增殖。1×10-6、1×10-8 mol/L的辛伐他汀也明显促进成骨细胞的增殖(P-7 mol/L的浓度作用更强(P-9 mol/L的浓度对增殖无明显影响（见表1）。联合使用两种药物后，成骨细胞的增殖率比单一药物有明显的增强（见表2）。�2．3 药物对成骨细胞碱性磷酸酶的影响 4种浓度的辛伐他汀对碱性磷酸酶的分泌都有明显的促进作用，以10-8 mol/L的作用最强（P-7、10-8、10-9mol/L的阿仑磷酸钠也能明显促进碱性磷酸酶的分泌，以10-7 mol/L的浓度作用最强（P-7 mol/L阿仑磷酸钠与10-8 mol/L辛伐他汀混合后较单一药物的刺激作用更强（见表4）。
3 讨论�
临床上阿仑磷酸钠和辛伐他汀分别被用来治疗骨质疏松症和高脂血症，阿仑磷酸钠对破骨细胞有较强的抑制作用。近来人们发现两种药物都影响胆固醇代谢中的甲羟戊酸途径。阿仑磷酸钠通过抑制焦磷酸法尼酯合成酶减少甲羟戊酸途径中焦磷酸法尼酯的合成，从而抑制了GTP结合蛋白酶如Rho、Rac等翻译后的异戊烯化作用，导致破骨细胞凋亡，抑制骨吸收。而辛伐他汀通过抑制胆固醇合成途径中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶阻断甲羟戊酸途径，防止破骨细胞活化，但他汀类药物缺乏含氮二磷酸盐结合到骨矿化表面的能力，因此它对破骨细胞的抑制作用需进一步研究。�
最近人们在研究中发现，他汀类药物对成骨细胞和骨形成也有一定的作用。Mundy等[1]发现他汀类药物能够明显促进骨形成，这种作用与骨形成蛋白-2（BMP-2）的表达增强有关。Maeda等[2]发现辛伐他汀能够明显促进成骨细胞碱性磷酸酶的活性和矿化作用，这伴随着BMP-2和Ⅰ型胶原的表达增强。Ohnaka[3]研究发现匹伐他汀在使人类成骨细胞BMP-2和骨钙素表达水平明显增加时，如果加入GGPP（geranylgeranyl pyrophosphate），则可以抑制匹伐他汀的作用，而GGPP促进小GTP结合蛋白如Rho的异戊烯化作用，同时Rho的特异性抑制剂Hydroxyfasudil也可以导致BMP-2和骨钙素表达水平增加，由此推断他汀类药物可能通过抑制Rho、Rho激酶的活性来上调BMP-2的表达。BMP-2进一步通过激活和诱导成骨细胞特异性转录因子Cbfal的功能及表达刺激成骨细胞分化[4]。他汀类药物还可以抑制多能干细胞向脂肪细胞分化，当脂肪细胞分化增多时，成骨作用降低，Nishio发现洛伐他汀通过抑制脂肪细胞分化促进成骨作用[5]。�
虽然二磷酸盐治疗骨质疏松的主要机制是抑制破骨细胞的骨吸收，但有学者发现二磷酸盐可以促进成骨细胞增殖和抑制其凋亡[6,7],Irina使用3种不同的二磷酸盐均能观察到成骨细胞数量增加[8]。二磷酸盐是通过什么机制促进成骨的呢。Follet等[9]发现二磷酸盐可以抑制骨细胞的凋亡，Duque 等[11]发现阿仑磷酸钠能明显促进间充质干细胞向成骨细胞分化。Romanello等[11]发现二磷酸盐通过细胞外信号调节激酶(ERKs)的激活促进成骨细胞的有丝分裂，Irina也发现二磷酸盐刺激成骨细胞与ERKs的激活有关[8]，这可能是二磷酸盐促进成骨细胞增殖的作用途径。�
与这些研究结果类似，笔者在实验中发现阿仑磷酸钠和辛伐他汀都能明显刺激成骨细胞的增殖，并且能显著刺激成骨细胞分泌碱性磷酸酶，表明两种药物对骨形成都有一定的促进作用。同时也发现，药物的刺激作用和浓度不成正比，当增高到一定浓度时，成骨细胞的增殖和分泌碱性磷酸酶的能力反而降低，这可能是因为高浓度的药物对细胞有一定的毒性。本研究发现联合使用比单独使用其中一种药物更能促进成骨细胞的增殖和成熟，表明二者有协同作用，这为患有高脂血症的骨质疏松患者同时使用二磷酸盐和他汀类药物奠定了实验基础。�
参考文献
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［2］ Maeda T, Matsunuma A, Kawane T,et al． Simvastatin promotes osteoblast differentiation and mineralization in MC3T3-E1 cells． Biochem Biophys Res Commun,2001,280(3):874-877．�
［3］ Ohnaka K, Shimoda S, Nawata H,et al． Pitavastatin enhanced BMP-2 and osteocalcin expression by inhibition of Rho-associated kinase in human osteoblasts． Biochem Biophys Res Commun,2007,287(2):337-342．�
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［8］ Irina M ,Lilian IP, Cecilia LS,et al． Extracellar signal-kinase and calcium channels are involved in the proliferative effect of bisphophonates on osteoblastc cell in vitro．Bone Miner Res,2001,16:2050-2056．�
［9］ Follet H, Li J, Phipps RJ,et al． Risedronate and alendronate suppress osteocyte apoptosis following cyclic fatigue loading． Bone,2007,40(4):1172-1177．�
［10］ Duque G, Rivas D． Alendronate has an anabolic effect on bone through the differentiation of mesenchymal stem cells． J Bone Miner Res,2007,22(10):1603- 1611．�
［11］ Romanello M, Bivi N, Pines A,et al． Bisphosphonates activate nucleotide receptors signaling and induce the expression of Hsp90 in osteoblast-like cell lines． Bone, 2006,39(4):739-753．
