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【摘要】本文结合文献报道及本课题组实验研究,对小鼠前脂肪细胞的原代培养及鉴定进行了总结。同时,由于前脂肪细胞的分化与肥胖病的形成有密切的关系,故前脂肪细胞的培养具有很重要的研究意义。�
【关键词】前脂肪细胞;原代培养;鉴定�
doi:10.3969/j.issn.1006-1959.2010.09.124文章编号:1006-1959(2010)-09-2409-02
脂肪组织在体内有在胞浆内积聚脂滴的成熟脂肪细胞和虽未在胞浆内积聚脂滴但有这种潜能的前脂肪细胞。成熟的脂肪细胞呈圆形,前脂肪细胞呈梭形,成熟的脂肪细胞失去分裂及增殖的能力,而前脂肪细胞则有分裂和增殖的能力。由于前脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分化能力的特异化了的前体细胞,与肥胖有着非常密切的关系,笔者参照多本参考书及有关文献报道,在科研中对前脂肪细胞的培养及鉴定方法进行了验证和比较,结合本课题组反复的实践对其进行了总结,拟为进一步研究奠定基础。�
由于小鼠的取材比较方便,而且关于小鼠前脂肪细胞的培养研究得比较多,故本课题组所采用的前脂肪细胞均取自小鼠。�
1.材料与方法�
1.1实验材料:实验选用体重为18-22g的4周龄昆明种雄性小鼠。由成都中医药大学实验动物中心提供。动物在实验前适应性驯养1周,动物房温度和湿度分别维持在20℃和70%左右。实验药品主要有F12培养基、胰酶(Trypsin)、小牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)、油红O等。实验主要使用仪器设备包括二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置相差显微镜等。�
1.2实验方法:�
1.2.1小鼠前脂肪细胞的取材及原代培养:小鼠前脂肪细胞的培养方法,参照杨建梅等所发表文献��[1-3]�及《体外培养的原理与技术》��[4]�、《组织培养技术及其在医学研究中的应用》��[5]�等书所载方法进行培养。�
1.2.1.1断脊髓处死雄性小鼠,在培养室无菌条件下解剖小鼠,剪取小鼠附睾附近的脂肪组织,放入培养皿中的D-Hanks液中,反复洗涤之后,用剪刀充分剪碎,将组织移入离心管。�
1.2.1.2用吸管加入适量0.25%胰酶在37℃条件下消化(消化时间根据具体情况而定),离心后,收集沉底的细胞,在离心管内加入适量含20%小牛血清的F12培养液,用吸管混匀后吸取细胞及培养液经筛网过滤入另一离心管,上清及漂浮的脂肪组织弃去不用。�
1.2.1.3再次离心后,弃上清,沉积的细胞用培养液制成细胞悬液,接种至培养板或培养瓶中,并根据实验需要高调整细胞的密度。在倒置显微镜下观察细胞呈小圆形,置37℃,体积分数5%CO��2�培养箱内培养。�
1.2.1.424h后,用PBS轻轻洗去培养板或培养瓶内未粘附的物质,并更换培养液,如要维持前脂肪细胞的增殖则用含高血清(20%小牛血清)的F12培养液,如实验的目的是研究前脂肪细胞的分化则可更换为含低血清(10%小牛血清)或无血清的F12培养液,以后每2-3天换一次培养液。�
1.2.2小鼠前脂肪细胞的鉴定方法:�
1.2.2.1细胞形态学观察:在倒置显微镜下,动态观察胞浆内出现脂肪颗粒的程度和快慢并照相。也可进行油红O染色并照相。�
1.2.2.2MTT比色法及生长曲线的绘制:细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。现在,大多数实验室利用培养板采用MTT比色法测OD值来进行生长曲线的绘制��[6]�。�
1.2.2.3油红O染色提取法测定细胞内脂肪含量的动态变化:根据Ramirez等��[7]�方法动态测定,以OD值表示,画出时间-OD值曲线。�
1.2.2.4酶组织化学提取法测定前脂肪细胞分化过程中的标志物-甘油磷酸脱氢酶(GPDH)含量的动态变化:GPDH是前脂肪细胞分化中晚期的标志,根据Stuart等��[8]�的方法进行测定,以OD值表示,画出时间-OD值曲线。1.3统计方法:实验数据均以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS12.0软件进行统计学分析。单因素方差分析、组间差异分析采用t检验。�
2.实验结果与分析�
2.1原代培养小鼠前脂肪细胞的增殖过程:�
2.1.1小鼠前脂肪细胞的形态学观察:接种消化分离的细胞12小时基本可以贴壁,贴壁后初为小圆形,核/浆比例较大(见图1)。培养过程中始终应用含高血清(20%小牛血清)F12培养液。2天即可观察到细胞渐成梭形,在3天左右此梭形细胞开始增殖,4-10天加速,聚集性生长成放射状(见图2),细胞融合后生长减慢。增殖过程中的前脂肪细胞使用油红O完全不能着色。2周左右时部分细胞内出现少量脂滴,而这种自然成脂分化的细胞所占比例较少。�
图1小鼠原代前脂肪细胞 图2小鼠原代前脂肪细胞�
接种12h(未染色,×400)接种4d(未染色,×200)�
2.1.2小鼠前脂肪细胞的生长曲线,(见图3):�
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图3小鼠前脂肪细胞在含高血清F12培养液中的生长曲线�
由(图3可知),小鼠前脂肪细胞在3天开始增殖,4-10天加速,第11天左右进入增殖平台期。从生长曲线可知,小鼠前脂肪细胞的倍增时间为60h左右。�
2.2原代培养小鼠前脂肪细胞的分化过程:�
2.2.1小鼠前脂肪细胞的形态学观察:接种消化分离的细胞12小时基本可以贴壁,细胞贴壁后初为小圆形,核/浆比例较大。接种24小时后换用含低血清(10%小牛血清)F12培养液。2天即可观察到细胞渐成梭形,并且细胞体积增大。4天左右细胞胞浆内可观察到反光脂肪颗粒,大小不等且多散在(见图4)。随分化进展,积聚有脂肪颗粒的细胞增多。到1周或2周时,细胞由梭形逐渐变成椭圆形或圆形,分化成多脂滴或单脂滴的脂肪细胞(见图5),12-14天小脂肪滴融合成大脂肪滴并将细胞核推向细胞一侧(见图6)。胞浆中反光小滴聚积成葡萄串状,经油红O染色细胞内脂质特异性着红色,未分化细胞和细胞内非脂质聚积部分不能着色,提示为细胞内有富含脂肪的液滴,证实为脂肪细胞(见图7)。�
图4小鼠原代前脂肪细胞图5小鼠原代前脂肪细胞�
接种4d(未染色,×200)接种8d(未染色,×200)�
图6 小鼠原代前脂肪细胞图7小鼠原代前脂肪细胞�
接种14d(未染色,×400)接种8d(油红O染色,×400)�
2.2.2小鼠前脂肪细胞分化过程中细胞内脂肪含量的动态变化(见图8):�
图8细胞分化过程中细胞内脂肪含量的变化�
由(图8可知),小鼠前脂肪细胞内的脂肪含量于培养8d后迅速增加,16d左右到达高峰。�
2.2.3小鼠前脂肪细胞分化过程中细胞内分化标志酶-甘油磷酸脱氢酶(GPDH)含量的动态变化(见图9):�
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图9细胞分化过程中甘油磷酸脱氢酶(GPDH)含量的动态变化�
由(图9可知),甘油磷酸脱氢酶在4天左右开始上升并迅速增加,10天左右到达高峰并维持在较高水平。�
3.讨论�
3.1前脂肪细胞的来源。通过搜集文献资料发现,前脂肪细胞通常取自大鼠、小鼠和人,并且已建立了来源于鼠的前脂肪细胞的细胞株如3T3-L1、3T3-F442A、ob17系列等��[9]���[10]�。由于前脂肪细胞一般在7代以内细胞增殖迅速,分化率高,再往后则增殖和分化率开始降低。所以前脂肪细胞的培养最好采取原代培养,尤其是用于筛选药物时效果更好,影响因素也比较少。由于小鼠的取材比较方便、价格适中,而且关于小鼠前脂肪细胞的培养研究得比较多,故本课题组所采用的前脂肪细胞均取自小鼠。取材以雄性小鼠附睾处脂肪组织为佳,因为此处的脂肪组织不会与其它组织粘连。�
3.2前脂肪细胞的原代培养。关于小鼠前脂肪细胞的取材及原代培养的方法,虽然在很多文献及参考书中都有记载,但通过本课题组无数次的摸索终于确立了比较稳定的培养方法。通过消化法获取细胞后接种在培养瓶或培养板中,放入置37℃,体积分数5%CO��2�培养箱内培养。24h后,用PBS轻轻洗去培养板或培养瓶内未粘附的物质,并更换培养液。通过多次摸索发现,如细胞持续应用含高血清的培养液,细胞增殖迅速,但分化会受到抑制,不利于对细胞的分化进行研究。所以,如要维持前脂肪细胞的增殖则用含高血清(20%小牛血清)的F12培养液,如实验的目的是研究前脂肪细胞的分化则可更换为含低血清(10%小牛血清)或无血清的F12培养液。�
3.3前脂肪细胞的鉴定。由于原代培养的细胞成分比较复杂,所以在正式实验前必须对所培养的细胞进行鉴定,以使实验的结果真实可信。由于前脂肪细胞存在增殖和分化两个不同的过程,所以为了对前脂肪细胞进行鉴定,也要分为两个过程进行指标检测。�
3.3.1原代培养小鼠前脂肪细胞的增殖过程:在增殖过程中,所用培养液为含20%小牛血清的F12培养液。�
在倒置显微镜下动态观察细胞,细胞的形状由小圆形渐成梭形,细胞数量增殖明显,聚集性生长成放射状。胞浆内基本无脂肪颗粒,直至2周左右时部分细胞内出现少量脂滴。从形态可知,该细胞来源于脂肪组织,细胞呈梭形,胞浆内无或有很少脂滴。�
细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。所以,在增殖过程中要绘制小鼠前脂肪细胞的生长曲线。目前大多数实验室采用的方法是利用培养板采用MTT比色法来进行生长曲线绘制。MTT比色法的检测原理为细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲�(formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲�,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。通过生长曲线的绘制,观察到小鼠前脂肪细胞在3天开始增殖,4-10天加速,第11左右进入增殖平台期。从生长曲线可知,小鼠前脂肪细胞的倍增时间为60h左右。说明该细胞增殖迅速,并且与来自同一个体的成纤维细胞在倍增时间上接近。�
3.3.2原代培养小鼠前脂肪细胞的分化过程:在分化过程中,在细胞接种24h后,换用含10%小牛血清的F12培养液。�
在倒置显微镜下动态观察细胞,细胞形状由小圆形变为梭形再变为椭圆形或圆形,在胞浆内也逐渐出现反光颗粒,并且颗粒逐渐变为反光小滴。由于经油红O染色细胞内的脂质可特异性着红色,反光小滴在油红O染色后呈红色,提示为细胞内有富含脂肪的液滴,证实为脂肪细胞。由于该细胞的胞浆逐渐出现脂肪颗粒及脂滴,说明其具有分化为脂肪细胞的潜能。油红O是一种特异的可以和细胞内甘油三酯结合的红色染料,与未分化细胞和细胞外脂质不结合。有文献报道其准确性和敏感性与测定前脂肪细胞分化过程中的标志酶GPDH相似。因此我们用油红O染色提取法这一简便、快速的方法对体外培养的前脂肪细胞进行鉴定,同时作为对体外培养的前脂肪细胞分化程度的间接定量分析的指标。结果表明,小鼠前脂肪细胞在培养2天后开始有脂肪的积聚,4天后积聚量明显增多,于培养8d后迅速增加,16d左右到达高峰,与形态学上的培养4天后细胞内出现脂肪颗粒相吻合。�
众所周知,甘油磷酸脱氢酶(GPDH)是甘油三酯合成所必需的限速酶,其最终促使前脂肪细胞发生细胞形态的改变,胞浆充满脂滴,变成脂肪细胞。甘油磷酸脱氢酶(GPDH)是前脂肪细胞分化中晚期的标志��[11]�。GPDH含量的测定有2种方法:第1种方法,参考Hauner方法��[12]�,细胞培养到一定时间,用PBS(pH7.4)冲洗,25mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.5)含EDTA1mmol/L收集细胞,超声波细胞粉碎仪40W、10s粉碎细胞,标本-70℃保存。GPDH测定采用速率法测定NADH消耗速率,使用生化分析仪,反应溶液包括100mmol/L三乙醇胺-HCl缓冲液(pH7.5),2.5mmol/LEDTA,0.1mmol/L巯基乙醇,0.4mmol/LNADH,4mmol/L磷酸二羟丙酮。GPDH测定结果以每克蛋白质的IU表示(IU/g)。蛋白质测定采用考马斯亮蓝方法;第2种方法,本课题也采用这种方法,即酶组织化学提取法,根据Stuart等的方法进行测定,画出时间-OD值曲线。结果表明,甘油磷酸脱氢酶在4天左右开始上升并迅速增加,10天左右到达高峰并维持在较高水平。同时发现,甘油磷酸脱氢酶的迅速增加先于脂肪含量的迅速增加,说明酶的出现在前,脂肪的出现在后。�
本课题目研究中采用了酶消化法获得了成分均一,增殖和分化均旺盛的梭形细胞,经以上4种鉴定方法,证明是具有典型特征的前脂肪细胞,符合文献中提出的3个标准��[13]�,即:①来自脂肪组织,形态为梭形,胞浆内无或很少有脂肪颗粒。②增殖迅速,与来自同一个体的成纤维细胞在倍增时间上接近。③在形成单层汇合后能变为脂肪细胞,包括脂肪细胞特异性酶的出现和胞浆内出现脂肪颗粒,并且胰岛素是这个过程中的主要促进因素。这4种鉴定方法的选择,均源于前脂肪细胞所具有的生物学特性,如甘油磷酸脱氢酶(GPDH)在前脂肪细胞分化的中晚期出现,是分化的标志酶之一;通过形态学方法观察到脂滴的出现,相应地细胞内脂肪含量也会增加。
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