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[摘要] 目的 研究本地区HCV病毒分离株的分型,为临床治疗提供依据。方法 利用PCR技术克隆并测定NS5B基因片段的核苷酸序列,并对其核苷酸和氨基酸序列进行比较分析。结果 克隆的NS5B片段的核苷酸和氨基酸序列与HCV-Ⅱ型代表株相应部分序列的同源性最高,而且氨基酸序列比较结果显示,37个分离株中RNA聚合酶结构及其相关序列无任何变异。结论 该分离株应属HCV-Ⅱ型。NS5B基因片段可能在病毒复制中起重要作用。
[关键词] 丙型肝炎病毒; RNA聚合酶; 基因分析
[中图分类号] R34 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)07-71-02
The Application of PCR Technology in Hepatitis Virus RNA Polymerase Gene Analysis
SUN An"min
First People"s Hospital of Kaifeng,Kaifeng 475000,China
[Abstract] Objectiveand MethodsBy using PCR technology we cloned and determined the nucleotide sequencein the gene fragments of NC5B,and its nucleotide and amino acid sequences were compared. ResultsThe results showed that the cloned NS5B fragments of nucleotide and amino acid sequence nearly have the same character with the corresponding partial sequence in the HVC-Ⅱ type which indicating that should be HVC-Ⅱ type. ConclusionThe result showed that the seven isolated viruses of RNA polymerase structure and its related sequences remained the same without any mutations,hence we suggested this research could play an important role in viral replication.
[Key words]Hepatitis virus; RNA polymerase; Genetic Analysis
丙型肝炎病毒是引起输血后肝炎的主要病原。1989年美国Chiron公司鉴定并将引起输血后肝炎的病原命名为丙型肝炎病毒(HCV)以来,人们已基本阐明了HCV的基因组结构。HCV基因组为单股正链RNA,全长约9.5kb,包括5"端的结构基因及3"端的非结构基因。分别编码结构蛋白和非结构蛋白。基因组非结构区NS5基因编码一种NS5B蛋白,该蛋白具有一种赖于RNA聚合酶结构域(GDD),提示该蛋白可能与病毒的复制有关[1,2]。为了进一步研究HCV-RNA聚合酶的结构与功能,我们克隆了HCV-RNA聚合酶基因并对其序列进行了分析。现将有关结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 引物合成
依据HCV-BK序列,设计了扩增HS5B片断的巢式引物。外引物 F1:5"-ATGGGCTCCTCATACGGATTCC-3",R1:5"-TGATGTTATCAGCTCCAAGTCG-3’;内引物F2:5"-GGAATTCCGAGTTCCTGGTGAATAGGTGG-3",R2:5"-CGTCTAGAGCAGTACCTAGTX- ATAGCCTC-3"。在内引物的5"端分别加上EcoR I和Xba I酶切位点以利于克隆。引物合成采用381A DNA自动合成仪(Milligen/Biosearch)。
1.2 血清标本
37份阳性血清来自本地区,经Abbot第二代HCV检测试剂测定抗HCV抗体强阳性,用HCV5"非编码区引物扩增证明为HCV-RNA阳性。
1.3 RNA模板的提取
HCV-RNA的提取采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法[3,4],异硫氰酸胍和焦碳酸二乙脂(DEPC)为Fluka试剂,RNAsin购自华美生物工程公司。
1.4 PCR反应
参阅文献[5]。逆转录与第一轮PCR反应在同一反应管中,即在同一PCR缓冲液中进行。在完成逆转录反应后,选退火温度42℃反应5个循环,以确保扩增成功。随后94℃55s、55℃72min、72℃1.5min再反应30个循环。第一轮PCR反应完成后,以其产物为模板,用内引物进行第二轮扩增,PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。
1.5 cDNA片段的克隆及序列测定
将获得的cDNA片段克隆至M13mp18/19中,分别从正反两个方向测定序列。宿主菌JM103为本室保存,RF型M13mp18/19、限制性内切酶购自华美生物工程公司或中国医科院基础所,T4DNA连接酶、WizardTM M13DNA Purification System购自Promega公司。单链模板的制备参照使用说明,序列测定采用Tag DNA聚合酶及标记的通用引物,在ABI390A全自动序列分析仪上进行。
1.6 序列比较分析
将所测cDNA序列与HCV I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型(HCV的基因分型表1)代表序列HCV-l、HCV-J、HCV-J8、HCV-BK、HCV-TW和HCV-CH[6]的相应部分进行核苷酸及氨基酸序列比较。核酸分析采用Goldkey软件。
2 结果
2.1 cDNA片段的扩增
琼脂糖凝脂电泳结果显示,有33份血清扩增出预期大小为454bp的cDNA片段。图1(单位:bp)是几例样品的cDNA片段扩增后的电泳结果。
2.2 cDNA片段的序列测定
将cDNA片段克隆至M13mp18/19中,从正反两个方向测定序列,由结果可知,cDNA片段长454bp,G+C含量为55%,推测氨基酸151个,经与原依据序列比较,证明为NS5区的基因片段。
2.3 核苷酸和氨基酸序列比较
将克隆的NS5B片段与I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型代表株HCV-l、HCV-BK、HCV-J6、HCV-J8和中国台湾株、本地区株相应区段的核苷酸及氨基酸序列进行多序列比较。结果表明,NS5B基因片段与Ⅱ型序列HCV-BK、HCV-TW和HCV-CH的同源性最高,核苷酸同源性为92.5%～94.4%,氨基酸同源性为94.5%～98.0%;与I、Ⅲ、Ⅳ型代表株的同源性为68.5%～80.9%,氨基酸同源性为73.8%～87.6%,表明本研究中的分离株为HCV-Ⅱ型。NS5B蛋白中的RNA聚合酶结构域(GDD)及相关氨基酸序列在比较的7个不同分离株中高度保守,均未发生变异。
3 讨论
3.1 逆转录与PCR反应
由于丙肝患者的血中RNA滴度较低,所以本研究采用逆转录与第一轮PCR反应在同一管中进行,而且在逆转录反应完成后,先以低退火温度反应5个循环,第一轮PCR完成后,以其产物为模板,用内引物进行巢式扩增,巢式PCR反应的敏感性比第一轮PCR反应高10倍左右。在第一轮PCR中先进行42℃退火5个循环,可有效地提高扩增效果。在HCV-RNA阳性血清中可能存在RNA复制的中间体-负链RNA,将逆转录与第一轮PCR在同一管中进行,由于同时加入正反向引物,逆转录反应可同时双向进行,使cDNA模板量增加,增强了扩增效果。此外,逆转录与第一轮PCR反应在同一管中进行,也减少了由于反复加样操作污染的可能性。
3.2 核苷酸与氨基酸序列比较
HCV为一高度变异的RNA病毒,不同的分离株其核苷酸和氨基酸序列不同。本实验克隆的NS5B片段,其核苷酸和氨基酸与HCV-Ⅱ型同源性最高,与Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型同源性较低,表明本研究的分离株属于HCV-Ⅱ型。本研究的分离株与HCV-CH来源于同一地区,同为HCV-Ⅱ型,在一定程度上说明本地区HCV流行株的类型。
HCV虽然高度变异,但某些具有重要功能的氨基酸序列则高度保守,如NS3区的丝氨酸蛋白酶活性中心和NS5B区的RNA聚合酶结构域(GDD)等序列。本研究比较了37个不同HCV分离株的NS5B基因片段的氨基酸序列,RNA聚合酶中GDD及相关序列高度保守,预示该区可能在病毒的复制中起重要作用。
[参考文献]
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(收稿日期:2009-12-15)
