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【摘要】目的研究BCG激活的淋巴细胞对膀胱肿瘤细胞株TBC－1的杀伤作用。方法分离人外周血中的淋巴细胞，分别经BCG和IL－2刺激，检测淋巴细胞的增殖及其对TBC－1的杀伤活性。结果�
BCG刺激的淋巴细胞于不同效靶比40∶1、20∶1、10∶1对TBC－1的杀伤活性分别为（42.36±3.86）%、（29.19±2.39）%、（14.36±1.68）%。结论BCG刺激的淋巴细胞对膀胱肿瘤细胞株TBC－1有杀伤作用。�
【关键词】膀胱肿瘤;卡介苗;淋巴细胞
BCG为结核杆菌的减毒活疫苗，其主要成分是卡介苗核糖核酸，具有很强的非特异性免疫刺激作用，BCG可刺激人单个核细胞产生IL－2、IL－12、IL－6和IFNγ20,诱导辅助性T淋巴细胞(Th)、B淋巴细胞、天然杀伤细胞(NK)、活化的淋巴细胞、树突状细胞(dendriticcell，DC)表面的MHC.I类分子和协同刺激分子的表达均明显上调,其诱导的机体免疫反应是一种典型的Thl型免疫反应。�
本实验以活BCG刺激人外周血中的淋巴细胞，IL－2扩增诱导产生抗膀胱肿瘤效应细胞，研究BCG激活的淋巴细胞对膀胱肿瘤细胞株TBC－1的杀伤作用。�
1材料和方法�
1.1BCG激活的淋巴细胞和LAK细胞的培养及增殖的测定
新鲜外周静脉血10ml，梯度密度离心法提取单个核细胞,静置1h，去除单核细胞，台盼蓝染色，活细胞数大于95%者，用含10%人AB血清的RPMI－1640完全培养基调整细胞浓度为1.0×10�6/ml。分别按7.5ug/ml(3.75×10�4CFU/ml)加入活BCG，按500u/ml加入IL－2，置37℃、5%CO�2饱和湿度下培养，3d换液1次，于第7天更换含IL－2500u/ml的RPMI－1640培养基，继续置37℃、5%CO�2饱和湿度下培养，每3d换液1次，于14d收获BCG激活的淋巴细胞，于7d收获LAK用于实验。继续培养，分别培养至30d，测定活细胞数。�
1.2BCG激活的淋巴细胞和LAK细胞对TBC－1的细胞毒作用测定
计算不同效靶比40∶1、20∶1、10∶1�BCG激活的淋巴细胞和LAK细胞对TBC－1的杀伤活性（MTT法）用酶标仪在检测波长492nm，参考波长650nm下测定OD值（492-650nm）。计算结果:杀伤活性(%)=［1－(实验组OD值－单独效应细胞组OD值)/单独靶细胞组OD值］×100%�
1.3统计学方法
全部资料结果以（x±s）表示，采用配对t检验，使用SPSS10.0统计分析软件进行统计分析。�
2结果�
2.1BCG激活淋巴细胞与LAK细胞的增殖倍数比较
BCG激活淋巴细胞于培养的6、12、18、24、30d细胞增殖倍数分别为3.08±0.34、8.27±0.55、25.21±3.01、46.39±3.20、40.21±2.19。LAK细胞于培养的6、12、18、24、30d细胞增殖倍数分别为4.53±0.33、9.14±0.30、20.76±1.78、19.44±1.50、16.35±2.74。�
BCG激活淋巴细胞与LAK细胞的细胞毒作用比较�
BCG激活淋巴细胞与LAK细胞的细胞毒作用在效靶比10∶1时，差异无统计学意义。在效靶比40∶1、20∶1时，有显著性差异。�
3讨论�
BCG的抗肿瘤活性与其能够激活NK细胞关系密切。有研究发现，连续四周给接种肿瘤的小鼠注射活的BCG能明显延长小鼠的生存期，而给NK细胞缺陷的小鼠注射BCG以及用单克隆抗体中和NK细胞表面分子NK1.1时均可导致BCG抗肿瘤活性消失［1］。�
膀胱癌患者的免疫功能低下，外周血IL－2及NK活性降低。提高患者的免疫功能，降低复发率就显得非常重要。NK细胞在机体免疫监视与杀伤肿瘤效应中起重要作用。BCG是NK细胞的强烈诱导剂与活性调节剂，在免疫调节网络中，BCG通过直接诱导、激活T、T4、NK、MΦ产生IL－2与IFN。后者可进一步刺激NK细胞增殖与分化，使前体NK细胞转化成具有强烈细胞毒效应的成熟NK细胞［2］。研究表明：BCG能上调膀胱肿瘤细胞表面MHC－Ⅱ类分子、CD1、CD80和ICAM－1的表达，而且经过BCG诱导的MBT－2细胞能够刺激淋巴细胞分泌IL2和IFN7，这些结果提示：膀胱肿瘤细胞经BCG刺激后获得了抗原递呈细胞的特点和功能［3］。有研究表明：BCG细胞壁是通过与TLR2和TLR4结合来刺激细胞因子的产生［4,5］。�
用结核杆菌感染TLR4缺陷的C3H／HeJ小鼠和TLR4表达正常的C3H／HeN小鼠，结果C3H／HeJ小鼠从肺部清除结核杆菌的能力大大减弱，使结核杆菌从肺部播散至脾和肝脏，并在5-7个月内死亡，而C3H／HeN小鼠却能控制住感染且无一死亡；C3H／HeJ小鼠肺部分泌TNFα、IL－12p40单核细胞趋化蛋白1的水平明显下降；用C3H／HeJ小鼠的巨噬细胞在体外与BCG共培养，其巨噬细胞产生TNFα的水平显著下降。这些结果表明机体产生针对BCG的保护性免疫反应需要TLR4受体的参与［6］。�
纤维素结合蛋白(Fibronectin)对BCG的抗癌作用也非常重要，BCG首先与膀胱上皮细胞的纤维结合蛋白结合，然后才能发挥其抗肿瘤活性。［7,8］�
研究证明，BCG是一种Thl型免疫反应的强有力的诱导剂，它可刺激产生IFN的Thl淋巴细胞的发育和大量聚集、活化。实验证明BCG含有许多免疫刺激分子，如分支杆菌的细胞壁成分(mApG和相关的脂多糖)，其分泌的蛋白质以及分支杆菌释放的DNA的非甲基化拷贝等，均可诱导产生Thl反应［9］。�
BCG激活肿瘤杀伤系统是通过激活效应细胞和提高膀胱癌患者肿瘤细胞的敏感性，而且BCG所提高的细胞毒性作用主要是针对膀胱癌细胞的，这样的研究结果可以解释为什么膀胱内灌注BCG治疗膀胱癌具有较好的临床疗效。BCG是一种活的减毒牛型结核分支杆菌，它通过调动自身机体的免疫功能以达到抗肿瘤的目的，其抗肿瘤作用机制为：①BCG具有高亲和力纤维连接蛋白(FN)的受体，而发生炎症或创伤的膀胱黏膜较正常的膀胱黏膜上皮细胞FN多200倍，就使更多的肿瘤细胞与BCG黏附后造成细胞表面超微结构的损伤；②腔内灌注BCG后，膀胱黏膜发生严重的炎症反应与损伤，尿中可见大量的上皮细胞脱落，黏膜层次由6-7层减少至2-4层，其诱发的膀胱急性反应或慢性肉芽肿性膀胱炎被认为是一种继发性非免疫学抗肿瘤机制；③BCG灌注后可引起ILS、TNF、IFN等细胞因子的局部分泌增加，以及外周血免疫细胞增殖和活性增加，尿路上皮和固有层中CI)4+和CD8+细胞增加，这些是BCG介导的局部免疫效应，使肿瘤细胞不断地溶解、凋亡或清除；④当BCG通过纤维连接蛋白介导黏附于肿瘤与黏膜上皮细胞后，抗原提呈细胞在识别、吞噬与清除BCG感染细胞的反应中，将BCG抗原提呈给T淋巴细胞和NK细胞并使之激活，一方面促进T淋巴细胞和NK细胞表达FasL，另一方面增强膀胱细胞表达Fas抗原，通过激活Fas抗原使凋亡信号迅速传递至细胞内，而使肿瘤细胞凋亡［10］。�
本实验通过使用活BCG和IL－2联合刺激扩增人外周血淋巴细胞，经体外培养2-3周，可以收获大量活化的BCG激活的淋巴细胞，将其应用杀伤膀胱肿瘤细胞株TBC－1，发现BCG激活的淋巴细胞对膀胱肿瘤细胞株TBC－1有杀伤作用，为临床应用提供了科学依据。
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