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【摘要】目的：建立大鼠真皮间充质干细胞的分离培养扩增的方法。方法：用0.25%的胰蛋白酶消化分离表皮与真皮，然后0.1%I型胶原酶消化获得单细胞悬液，离心后去上清加入适量L-DMEM完全培养基，放入24孔板，置37 ℃，5% CO2培养箱培养。结果：培养3天后出现少量贴壁细胞，呈长梭形，10天后基本长满单层。细胞传代后增殖速度明显加快。结论：用酶消化法能分离得到真皮间充质干细胞。
【关键词】真皮；间充质干细胞；大鼠；培养
文章编号：1009-5519（2008）23-3488-03 中图分类号：R37 文献标识码：A
皮肤是脊椎动物身体上最大的器官，它具有许多功能，包括体温调节，传导触觉，保护身体免受外界的侵袭和伤害。皮肤主要有两层，表皮和真皮。表皮是由角化细胞组成的多层鳞状上皮，真皮由乳突层和网状层两层[1]。真皮不能再生，缺损后由纤维组织来修复，这就会失去皮肤的许多功能，影响个体生活质量。皮肤组织工程的研究为此类患者的治疗提供了希望。皮肤组织工程有3个重要的因素：种子细胞，支架材料，以及两者的结合。国内外已经有不少学者对皮肤组织工程的种子细胞进行了研究。研究较多的主要为表皮干细胞和骨髓间充质干细胞。自2000年，加拿大研究者Toma等[2]从幼年及成年大鼠皮肤中分离出真皮干细胞，这种细胞分裂增殖能力强，具有多分化潜能，是一种新发现的来源于真皮的多能干细胞，就掀起了对DMSCs的研究热潮。近来，国内外学者对DMSCs分离、纯化、体外扩增和冻存的研究进行了不断的探索。本研究应用酶消化法，从大鼠真皮中分离出DMSCs并进行纯化增殖，以及观察真皮间充质干细胞（DMSCs）的生长情况，并对DMSC的冻存条件进行研究，为进一步的实验研究打下基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器：SD大鼠购自浙江省实验动物中心，L-DMEM 为Gibco产品，胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司），胰蛋白酶为Sigma产品，二甲基亚砜(DMSO)由江苏鸿声化工厂生产的分析纯，24孔塑料培养板为Falcon产品，25 cm2、75 cm2塑料培养瓶为Orange产品。
1.2 大鼠DMSCs提取：（1）取出生1天内的SD大鼠幼鼠1只，引颈处死后，浸入事先配好的75%酒精中消毒3分钟；（2）将幼鼠从酒精中取出，放入大平皿中，用眼科剪和镊子将幼鼠背部皮肤小心剪下，用PBS漂洗，剔除脂肪组织后，将整块皮片面朝下放入预先加了适量0.25%胰蛋白酶的小平皿中，浸没为宜，放37 ℃培养箱，消化4 h。（3）4h后取出平皿，将皮片取出放入干的平皿中，小心将表皮与真皮剥离。（4）将真皮剪成碎末状，加入0.1%I型胶原酶适量，4℃消化过夜。（5）将消化好的组织加入L-DMEM培养基后离心1000 r/m×5 min，弃上清，加适量的培养基混匀后吸入24孔培养板，每孔2 ml，置37 ℃，5% CO2培养箱培养24小时后换液，以后每周换液2次。3天后出现细胞克隆，10天后，细胞基本长满单层，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化约4 min，得到原代DMSCs悬液，再以1×104 cells/cm2传代培养。传代细胞以75 cm2、25 cm2塑料培养瓶培养。并按此方法反复传代增殖，每日用倒置显微镜观察。换液过程中弃除悬浮生长的杂细胞，传代时严格控制酶的量和消化时间。
1.3 大鼠DMSCs的生长曲线测定：取生长良好的第二、四、八代DMSCs，用0.25%的胰蛋白酶消化，均以1×104 cells／m1接种于24孔板，每天各取2孔消化计数，每孔计数3次，计算均值，连续10d。以培养时间为横轴（t/d），细胞数为纵轴，绘制生长曲线。
1.4 大鼠DMSCs的冻存及复苏：将生长旺盛并已基本长满瓶底的第三代细胞消化，用1 ml的L-DMEM完全培养基 （含10%牛血清）将细胞冲洗下来，加入1 ml二甲基亚砜（DMSO）与牛血清（FBS）的混合液（DMSO∶FBS为1∶3），混匀后加入冻存管中，细胞的终浓度为2×106 cells/ml，放入厚壁塑料泡沫盒中，密封，置-60℃冰箱过夜，再放入液氮罐保存。6个月后，将冻存管从液氮罐中取出，立即放入37 ℃温水中，并轻轻摇动使其快速融化，在无菌条件下将液体移入离心管中加4 ml L-DMEM培养基混匀后离心，1000 r/min离心5 min，取出，弃上清，加入少量培养基将细胞团吹散后移入培养瓶，加适量的培养基，5% CO2、37 ℃、饱和湿度培养。观察其生长增殖情况。
2 结果
2．1 大鼠DMSCs分离与培养：经过酶消化后的真皮组织呈现白色，将消化后的消化液及组织离心后，弃上清，加入适量培养基后吹打，把细胞悬液及组织直接接种培养24h后，观察发现孔内有大量的小圆形的细胞，3天后出现细胞克隆（见图1），10天后，细胞基本长满单层（见图2）。细胞贴壁生长，呈长梭形，细胞传代后增殖速度较原代细胞快，约5天长满培养瓶底。多次传代的DMSCs融合生长时，细胞呈成纤维细胞样（见图3），传代11代，细胞仍生长旺盛，形态无明显变化。
2.2 大鼠DMSCs的生长曲线测定：第二、四、八代细胞生长曲线（见图4）。从生长曲线可见，大鼠DMSCs具旺盛的增殖能力，所测各代生长曲线相似，均呈“∫”形，但随着代数的增加，细胞生长有所减慢。细胞培养1d时，细胞稍有减少，为细胞的适应期。4d后细胞数迅速增加，为对数生长期。8d时达到顶点进入平台期，细胞保持动态平衡状态。
2.3 大鼠DMSCs的冻存及复苏：大鼠DMSCs经6个月冻存后复苏培养，细胞形态及生长状况与冻存前无明显差别，均呈长梭形。液氮保存存活率为80%，细胞生长增殖旺盛。提示大鼠DMSCs可用液氮保存，且不影响细胞的活力。这对进行DMSCs研究提供了方便的细胞来源，并对择期进行DMSCs的移植有重大的意义。
3 讨论
目前研究者对骨髓来源的间充质干细胞研究比较多，对于真皮等其他来源的间充质干细胞的研究不多，都处于初级阶段，对于它们的分离纯化培养方法也只是初步探索。从真皮中分离多能干细胞主要有两种方法，酶消化法[3]和一种类似神经干细胞培养方法[4~7]，这两种方法分离的细胞主要区别是前者主要表达间充质来源的特征，后者主要表达神经前体细胞特征。本实验利用了DMSCs具有贴壁生长的特性，采用酶消化法来分离获得真皮间充质干细胞。DMSCs原代生长是以克隆状向周边散发生长，传代后就不再出现该克隆状生长方式。DMSCs能在短时间内贴壁，生长旺盛，可在体外快速大量增殖。目前大鼠DMSCs已经传至12代，该DMSCs仍能保持旺盛的生长和增殖能力。对大鼠DMSCs的生长曲线的研究发现DMSCs大致呈“∫”形生长模式，即经历初期的适应期，然后迅速增殖，为对数增殖期，细胞长满后就进入生长平台期。所测各代DMSCs有相似的生长曲线。第三代的DMSCs经过液氮长期冻存后，复苏培养发现该DMSCs的生长增殖及形态与冻前无差异，这对择期进行DMSCs研究及移植手术具重要意义。
对DMSCs的研究主要存在一个分离后如何纯化及鉴定的问题。目前也只有通过不断传代来达到纯化细胞的目的，也没有一个鉴定DMSCs的金标准，只能根据DMSCs本身的特点设计检测方案，检测结果符合DMSCs的特点来证实分离获得的细胞为所需的DMSCs。但DMSCs有其无法替代的优点，如取材方便，体外增殖能力强，可进行自体移植治疗，避免了免疫排斥反应等特点。虽然DMSCs研究尚处于初级阶段，随着对它的不断深入研究，DMSCs作为皮肤组织工程的种子细胞，用于皮肤损伤的治疗将成为一种新的治疗选择。
参考文献：
[1] Stocum，DL.Regenerative biology and medicine[M].科学出版社，2007.21.
[2] Toma JG，Akhavan M，Fernandes KJ，et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin[J].Nat Cell Biol，2001，3：778.
[3] 史春梦，程天民.大鼠真皮多能间充质干细胞的分离培养[J]. 第三军医大学学报，2001，23（9）：1068.
[4] 崔苏萍，李 悦，谢 安，等. 大鼠真皮多能干细胞分离培养及其多分化潜能特性[J].中华实验外科杂志，2007，24（8）：1006.
[5] 柯昌能，利天增，徐盈斌，等．老年人皮肤多能干细胞的分离及有效扩增[J]．中华实验外科杂志，2005，22：1436．
[6] Femandes K3L，McKenzie IA，Mill P，et al．A dermal niche for multi-potent adult skin-derived precursor cells[J]．Nat Cell Biol，2004，6：1082．
[7] Toma JG．Isolation of skin-derived precursors (SKPs)and differentia-tion and enrichment of their Schwann cell progeny[J]．Nat Protoc，2006，1：2803．
收稿日期：2008-07-22
