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【摘要】目的：建立活络消肿搽剂中主药三七的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法测定三七中的人参皂苷Rg1，以水-乙腈梯度洗脱，在203nm波长下进行测定。结果：人参皂苷Rg1的线性范围为0.17mg/ml～1.7mg/ml，平均回收率在97.9%，线性方程：A=1534.9×C＋1.6657r=0.9999。结论：该方法操作简便、准确、重现性好，有利于提高活络消肿搽剂的质量控制水平。
【关键词】活络消肿搽剂；三七；人参皂苷Rg1；高效液相色谱法
1概述
活络消肿搽剂是利用云南特有及在民间常用的三七、草乌、金铁锁和重楼等四味主药药材加适量辅料制成的搽剂，是肿瘤医院院骨科经过多年的临床经验，开发一种应用于跌打损伤、关节肿痛等使用方便的一种外用搽剂，以期通过临床的验证后申请医院制剂。该制剂具有散瘀活血，消肿止痛之功效。为了对该制剂的直来那个进行有效的控制，在开发过程中选择君药三七中的人参皂苷Rg1进行对该产品的质量控制研究。
2仪器、试剂与试药
2.1仪器：BP221型电子天平北京赛多利斯电子天平有限公司；Agilent1100型高效液相色谱仪美国安捷伦公司；ShimadzuLC－10Atvp型高效液相色谱仪日本岛津公司；AgilentC18、DiamonsilC18十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（250×4.6mm，5μm）；
2.2试剂与试药：人参皂苷Rg1对照品（0703-200221）中国药品生物制品检验所提供；三七总皂苷对照品（060807）中国药科大学分析测试中心标定；D101型大孔树脂（200目）河北沧州宝恩化工有限公司提供；三氧化二铝（200目）上海五四化学试剂有限公司提供；
2.3供试品：活络消肿搽剂（规格：50ml）20091023、20091124、20091228、20091229、20100212、20100213、20100214我院制剂室试制；
乙腈均为色谱纯（美国Fisher公司），其余试剂均为分析纯。所用玻璃量具均已校正合格。
3检测条件及方法的确立
对活络消肿搽剂处方中几味药材进行分析，三七主要含三七总皂苷，草乌主要含生物碱、金铁锁主要含五环三萜类皂苷，重楼主要含薯蓣皂苷、重楼皂苷I和II。几味药材中三七和重楼具有成熟的高效液相测定法进行含量控制；鉴于三七是君药，而且为云南道地药材，对其研究比较多，对其成分也比较清楚，所以选择人参皂苷Rg1代表作为含量测定的控制指标。
检测波长的选择 参考《中国药典》2005年版中三七的检测方法选择的吸收波长203nm处测定三七中的人参皂苷Rg1。
前处理方法研究 原类似的中药制剂由于成分比较复杂，多采用于薄层扫描测定含量，很难准确定量地测定其中的目标成分的含量。经试验表明，供试品中含有糖类物质、皂苷和生物碱，通过大孔树脂处理能有效除去糖类物质，通通过三氧化铝处理能有效除去生物碱类和大量带有颜色的其他杂质。通过处理供试品可以直接用于高效液相分析。该前处理方法能有效消除干扰人参皂苷Rg1测定的物质，减小对色谱柱的影响。
色谱条件与系统适用性试验 参考《中国药典》2005年版中三七的检测方法采用C18色谱柱，在反相色谱体系中，选取水－乙腈作为流动相梯度洗脱（表1），流速为每分钟1.0ml，能有效分离大部分三七中所含物质，特别是Rg1与R1能完全分离，满足试验要求，色谱峰在60min内被完全记录，同时无干扰，符合药典规定。
表1：流动相梯度洗脱比例
对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Rg1对照品，加70%乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备 精密量取本品5ml，蒸至近干，加水5ml加热使溶解，放冷，通过101型大孔吸附树脂柱（用水湿法装柱，内径1.2cm，长12cm），用水50ml洗脱，弃去水洗脱液，再用70%乙醇150ml洗脱，收集洗脱液，通过中性氧化铝（3g，200~300目，干法装柱，内径1.2cm），收集流出液，用70%乙醇50ml洗脱，合并洗脱液和流出液，蒸干，残渣加70%乙醇微热使溶解，并转移至10ml量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
测定法 取上述两种溶液各5μl注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得。
4检测方法的方法学验证
4.1准确度的考察（采用加样回收率测定法）
储备液的配制 精密称定人参皂苷Rg1对照品，加入70%乙醇配制成每毫升含0.3mg对照品储备液A。
供试品溶液的制备 取供试品（20091023）适量，分别精密量取2ml本品共12份，任取3份，分别精密加入4ml储备液A；另取3份，分别精密加入5ml储备液A；另取3份，分别精密加入6ml储备液A；余下3份不加储备液A，将上述12份供试品按样品制备的方法进行处理，作为供试品溶液。
另精密称取人参皂苷Rg1对照品，加70%乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。取上述两种溶液各5μl注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得。结果如表2。
表2：活络消肿搽剂回收率实验结果
结果表明，在此色谱条件下，采用加样回收率法，按药典要求，在80%、100%、120%三个浓度范围内，每组浓度平行三次检测回收率总平均值97.9%左右，RSD%在2.3%，结果均较理想，基本满足药典要求。
4.2精密度考察
重复性 取供试品精密量取6份，照含量测定法检测，测定结果见表3。
表3：重复性试验
进样精密度 取对照品溶液，连续进样6次考察进样精密度，测定结果见表4。
表4：进样精密度试验
从表中结果表明，人参皂苷Rg1对照品连续进样保留时间平均为19.1分钟左右，相对标准偏差为0.69%，峰面积平均为490.52，相对标准偏差为1.55%；供试品平均含量为0.996mg/ml，相对标准偏差为2.5%。
4.3线性考察
取人参皂苷Rg1对照品约40mg，精密称定，置于25ml量瓶中，加入70%乙醇，制成1.6mg/ml的对照品储备液，分别精密量取储备液7ml、5ml、3ml、2ml、1ml，置10ml量瓶中加70%乙醇稀释至刻度，照含量测定法测定，结果见表5。以人参皂苷Rg1的浓度(mg/ml)为横坐标，以峰面积平均值(n=2)为纵坐标，进行线性回归计算，得到线性方程：A=1535.2×C＋1.3996 r=0.9999（n=6），见线性图。
表5：线性检测试验结果
图1、人参皂苷Rg1线性图
结论：人参皂苷Rg1在该方法下测定，峰面积与浓度具有良好的线性关系，线性范围：0.174mg/ml～1.736mg/ml。
4.4 溶液稳定性考察
取人参皂苷Rg1对照品溶液和供试品溶液，同条件不同时间检测考察其溶液稳定性，结果见表6。
表6：稳定性试验结果
结果表明，室温条件放置12小时，对照品和供试品溶液均稳定。
4.5 耐用性
在相同色谱条件下，不同仪器、色谱柱试验结果见表7。
表7：人参皂苷Rg1在不同色谱柱的测定情况
在相同色谱条件下，不同仪器和色谱柱测定结果能很好重现。
4.6专属性
按100ml处方量配制不含三七药材的活络消肿搽剂供试品，取该供试品5ml，按“供试品溶液的配制”方法制备阴性供试品溶液。
取活络消肿搽剂供试品溶液、阴性对照溶液和三七总皂苷对照品溶液，分别注入液相色谱仪。由结果可知，在选定的色谱条件下，溶剂、阴性对照不干扰活络消肿搽剂供试品溶液人参皂苷Rg1的测定，另外，供试品色谱图中，人参皂苷Rg1峰（保留时间为24.13分钟）能与其他成分峰有效分离，该色谱系统适用于测定人参皂苷Rg1（图2~4）。
4.7制剂中人参皂苷Rg1含量测定
利用制定的含量测定方法对多批活络消肿搽剂中Rg1的含量测定结果，见表8(图5、6)。
表8：多批活络消肿搽剂中人参皂苷Rg1含量测定结果
5讨论
通过对活络消肿搽剂的药材理化性质分析，大部分为皂苷和生物碱，经过比较不同的前处理方法和检测方法发现，经处理后的样品可直接采用高效液相法测定三七中Rg1和重楼中的重楼皂苷I、重楼皂苷II。综合考虑最终选择Rg1作为含量测定的指标。
笔者重点研究并建立了人参皂苷Rg1高效液相色谱含量测定法，排除了其他成分的干扰，专属性比较强，并按《中国药典》2005版一部相关要求，做了大量的实质性研究工作。采用HPLC检测方法对数批活络消肿搽剂小试和中试产品进行人参皂苷Rg1含量测定，各批供试品均大于0.5mg/ml，同时在药典相应的规定下进行了方法学验证，该方法准确可控平均回收率在97.9%左右，满足分析要求。
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