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【摘要】目的探讨应用PCR-STR分型技术快速产前诊断Down′s综合征的方法｡方法选择21号染色体上的4个多态位点D21S1435､D21S11､D21S1270 ､D211412 进行PCR扩增,尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染分型,根据谱带的条数和浓度进行判断是否为21三体｡结果应用此方法可以检出所有的由核型分析确诊的21三体,30例产前诊断筛出3例21三体患儿(有3条带图谱或2∶1图谱)｡结论该方法不用细胞培养,避免放射性标记,并可进行早期的产前诊断,该方法与传统的方法操作比较简单､速度快,是一种产前诊断和大规模筛查21三体的良好方法｡
【关键词】唐氏综合征;基因诊断;短串联重复序列
唐氏综合征(Down′s syndrome,DS)又称先天愚型,21三体综合征,是一种最常见的先天性常染色体数目畸变,发病率为0.12%,产前诊断以羊水细胞染色体核型分析为主,难度较大,周期长,不易普及｡短串联重复序列(short tandem repeat,STR)具有高度的多态性和易于检测､分型而成为第二代DNA分型技术的主要工具｡为此,我们尝试联合应用四个STR位点进行DS的基因诊断和产前诊断,以降低DS的发病率｡
1对象与方法
1.1对象30例经用DS筛查出来的高危孕妇羊水,由上海国际和平妇幼保健院遗传室提供｡
1.2方法
1.2.1DNA提取按Chelex-100 提取羊水细胞DNA[1]｡使用QIAamp DNA Mini Kit(德国),按试剂盒厂家提供的操作步骤提取上清液中游离DNA以代替羊水细胞DNA｡并用岛津紫外分光光度测定DNA浓度｡
1.2.2引物设计及PCR扩增待扩增的21号染色体上的4个STR位点见表1,参照基因数据库(www.省略)对其引物序列进行修改或自行设计,使该4个STR位点引物的退火温度一致(Tm=58℃)｡荧光标记物是每对引物的上游序列5′端用6-FAM荧光染料标记｡用PE2400热循环仪分别扩增各STR位点片段,PCR反应总体积25 μl,含样本DNA 0.05 μg,1×EX缓冲液(含2.0 mmol/L MgCl�2),200 μmol dNTP,引物5～10 pmol,0.5 U EX Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)｡4个STR位点的PCR反应条件一样,95℃预变3 min后,两步法循环30次;95℃变性15 s,60℃ 复性和延伸1 min｡最后60℃ 后延伸45 min｡荧光PCR扩增条件基本相同,但使用金牌TaqDNA聚合酶及其缓冲液,模板量为0.01 μg,95℃预变性10 min｡
1.2.3PCR产物的检测PCR产物用PAGE/银染法检测｡荧光PCR产物在ABI310测序仪上进行分析｡Genescan 3.1软件进行定量分析｡
1.2.4DS的基因诊断4个STR位点中有一个或多个位点在其特异性扩增片段长度范围内出现�1∶1∶1的3条带或�1∶1∶1的3个峰,作为DS的诊断标准,强度比为2∶1的2条带(峰)作为辅助诊断指标｡若未见3条带或峰,但多个位点表现为2∶1的2条带或峰,则高度怀疑为DS,应同时进行临床细胞遗传学检查,以明确诊断｡若未见3条带及2∶1的2条带或峰,可排除DS｡
1.2.5细胞遗传学检测30例高危孕妇的羊水细胞按常规方法进行染色体核型分析｡
2结果
2.1羊水DNA标本(正常)的STR位点扩增分析结果30例高危孕妇中有3例出现1～2个1∶1∶1三体带型(表2),其余位点为2∶1带型,而被诊断为DS｡另外,27例告危孕妇STR位点未见3条带型或2∶1带型,故均排除DS｡
2.2荧光PCR基因扩增片段扫描结果30例高危孕妇用ABI310测序仪检测出2例阳性结果,有1～2个STR位点呈3个峰,其面积比约1∶1∶1,其余位点呈两个峰,其面积比约�2∶1｡
2.3临床细胞遗传学检测其结果与应用STR位点进行PCR检测DS的结果完全一致｡但4对STR位点的PCR产物的带型分析2 d内即可完成,而羊水检查需3周时间｡
3讨论
在Down′s综合征患者中,95%是由于生殖细胞减数分裂时染色体不分离所致,致使子代含有1对遗传信息与母亲或父亲完全一样的21号染色体,额外染色体的存在使得21号染色体上的STR位点DNA图谱表现为1∶1∶1三体带型或2∶1带型,故可利用STR位点作为遗传标记,对Down′s综合征病例作出明确诊断｡
自1993年 Eggeling等[2]首次应用短串联重复序列(STR)作为遗传标记,利用荧光PCR对21三体患者作出了快速的基因诊断｡Bili等[3]进一步探讨了应用STR遗传标记进行快速基因诊断Down综合征的可行性,认为STR是定量PCR检测染色体数目异常最合适的遗传标记,并遵循孟德尔遗传规律,具有高度的多态性｡1999年张励 等[4]报道应用1～2个STR位点进行PCR-STR分型,结合银染或同位素标记DNA密度扫描行定量分析,从而快速诊断�Down′s综合征｡我们认为仅1～2个STR位点很难见到3条带型图谱,而只根据2∶1的2条带就作出三体的诊断存在一定的风险,因为模板量和PCR的循环数等诸多因素均可影响STR位点内2个等位基因扩增的比值｡我们选择的STR位点位于先天愚型的关键区域内(DSCR)内或附近,故单纯的21三体患者(占先天愚型的95%)和易位三体患者(占2.5%～5%)均可得到明确的诊断,这将为有效降低患儿出生,提高出生人口素质作出贡献｡
许多学者证明了人类绝大多数STR基因座有种属特异性[3],这意味着非人类来源的DNA模板在较高滴度或温度下,PCR在D21基因座上无扩增产物｡因此,细菌污染虽然会引起DNA降解,但对PCR扩增产物的特异性影响不大｡
近几年,国内外许多学者开始研究无创伤性产前基因诊断技术,即提取孕妇外周血分离､富集胎儿有核红细胞进行产前诊断[5],PCR-STR技术在此方面也有应用｡因此,此技术在STR连锁的疾病基因诊断中有广泛的应用前景｡
参考文献
1Walsh PS, Metzger DA, Higuchi R.Chelex 100 asa a medium for simple extration of DNA for PCR-based typing from forensic mterial.Biotechniques, 1991,10:506-513.
2Eggeling F, Fregtag M, Fashsold R, et al. Rapid detecton of trisomy 21 by quantitive fluorescent PCR.Hum Genet ,1993,6:567-570.
3Bili C,Divane A, Apessos A, et al. Prenatal diagnosid of common aneuploidies using quantitative flurescent PCR. Preant Diagn,2002,22:360-365.
4Zhang L, Jin CL, Wang RM, et al. Rapid detection of trisomy 21 by quantitative polymerase chain reaction. Chin J Med Genet, 1999,16:259-261.
5Samura O,Sohda S,Johnson KL,et al. Diagnosis of trisomy 21 in fetal nucleated erythrocytes from maternal blood by use of short tandem repeat sequences. Clin-chem,2001,47(9):1622-1626.
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