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摘要：目的：探讨组胺N－甲基转移酶(HNMT)在人类原发性肝癌组织中基因表达与肝癌的关系。方法：应用半定量逆转录一聚合酶链反应方法检测22例人类正常肝脏组织、36例人原发性肝癌旁组织和36例人原发性肝癌组织新鲜标本中基因mRNA的表达情况。结果：在肝癌组织中HNMT基因呈高表达。结论：肝脏中HNMT基因表达随肿瘤的发展而变化。
关键词：原发性肝癌；组胺N．甲基转移酶；RT-PCR
中图分类号：R735.7；R446.61
文献标识码：A
文章编号：1008－2409(2007)03－0435－03
组胺(Hisfamine)是人体内重要的自身活性物质，具有十分广泛而重要的生理作用，参与了多种疾病的病理生理过程。HNMT是体内催化组胺生物转化主要代谢酶，并且HNMT的N－甲基化是一些药物和外源性化合物在机体内生物转化的重要途径。在我国，原发性肝癌(primary hepatoeellular carcmo－ma)是发病率极高的恶性肿瘤。本实验首次在人类原发性肝癌与健康肝组织中测定组胺N－甲基转移酶(HNMT)的mRNA表达。对组胺HNMT在肝脏癌变中基因表达的进一步研究，将有助于阐明组胺代谢酶基因表达差异，为研究原发性肝癌患者肝组织内mRNA表达、可能的基因变异及肝癌本身在此中所起的作用提供重要的参考依据。本课题着眼于此，应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测HNMT在原发性肝癌组织中的表达情况。
1 材料与方法
1．1病例资料
36例原发性肝癌患者新鲜肿瘤组织标本均来自2005年10月至2006年8月广州市第一人民医院肝胆外科、肿瘤科收治的住院手术患者，组织标本均经病理检查证实为原发性肝癌。年龄33～78岁，其中男23例，女13例。对照组肝脏正常组织标本22例，原发性肝癌患者手术时同期切取远离原发性肝癌组织所在部位、外观正常的肝脏组织36例。对照组肝脏组织标本经病理检查均未见癌症表现。36例原发性肝癌病例经病理检查证实均为原发性肝癌。
1．2标本收集与处理
手术时切取的组织块立即投入液氮中后再转置于－70℃超低温冰箱保存待用。
1．3主要试剂与设备
1．3．1试剂DEPC、EB(AMRESCO公司，美国)，总RNA提取试剂Trizol、逆转录试剂盒(Promega公司，美国)。
1．3．2仪器BECKMAN低温微量离心机(德国)；PE 2400型PCR扩增仪(PERKIN ELMER公司，美国)；GEL DOS2000凝胶成像分析系统(Bio-Rad公司，美国)。
1．4实验方法
1．4．1 肝组织抽提总RNA 采用Trizol法提取组织内总RNA，取3μl置1.0％琼脂糖凝胶快速电泳鉴定总RNA质量，紫外分光仪测定总RNA的浓度及纯度后，余下RNA－70℃冻存备用。
1．4．2 RNA分析定性：1.5％琼脂糖凝胶电泳分析RNA质量。定量：用紫外分光光度计准确测定RNA浓度及鉴定纯度(A260／280)。
1．4．3逆转录合成cDNA第一链逆转录合成cDNA，在DE－PC浸泡过的无菌0.2ml EP管中加入2肛l总RNA溶液，70℃孵浴10min后置冰上，依次加入逆转录试剂，使最终反应体积为20μl。快速离心数秒，将酶灭活后－20℃冻存备用。
1．4．4 PCR引物序列设计选择结构蛋白基因磷酸甘油醛脱氢酶基因(glyceraldehyde phosphate dehydrogenas，GAPDH)为内参照基因。GAPDH基因的PCR扩增产物长度为30Tbp。
1．4．5 PCR反应 以已合成的cDNA为模板，在耐热的DNA聚合酶和上下游引物(见表1)作用下进行PCR扩增，CC下终止反应，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳。每份检测标本的PCR反应在相同条件下重复3次以保证其扩增的正确性和特异度。
1．4．6 PCR反应产物分析吸取PCR产物各5μl及加样缓冲液1μl加样器吹打混匀后加入凝胶的加样孔内。60V电泳90min至溴酚蓝指示剂到达胶长的2／3时中止电泳。
电泳结束后取出凝胶置于暗箱式紫外投射仪下观察、记录。当目的基因为阳性表达时，在凝胶的相应位置会出现被EB染色的特异性条带。
2 结 果
2．1总RNA抽提质量
Trizol法提取细胞总RNA，经紫外分光光度计准确测定各样品中RNA浓度及鉴定纯度(A260／280)，A260／280在1.8～2.0；1.5％琼脂糖凝胶电泳分析RNA质量，紫外灯下未降解的RNA可见三条明显rRNA区带(28s、18S、5S)条带间可见Smear样染色，为大小不同的mRNA(见图1)，说明所有试验组织标本总RNA抽提质量可靠。
2．2 RT-PCR的特异性
所有待检组织标本内参照GAPDH基因均为阳性表达，证实抽提的所有标本总RHA和PCR反应的可靠。
3 组胺H4受体的mRNA表达及其与原发性肝癌的关系
22例正常肝脏组织和36例原发性肝癌和癌旁组织中HNMT基因的阳性表达率间无显著性差异(P>0.05)，见图2。检测2组HNMT基因mRNA平均表达量，结果有显著性差异(P1、HM2受体拮抗剂和一些炔类单胺氧化酶抑制剂。
Girard等人于1993年首次克隆山人类肾脏HNMT cD－NA，HNMT基因长约34kb，含有6个外显子，定位于人类2号染色体上，研究表明HNMT具遗传多态性，HNMT基因外显子4中第314位碱基可发生C-T突变，导致第105个密码子编码的氨基酸发生Thr(苏氨酸)、lie(异亮氨酸)改变，lie 105纯合子的HNMT酶活性水平和热稳定性显著低于Thr105纯合子。
本课题研究结果表明：HMIT基因在正常肝脏组织、原发性肝癌和癌旁组织中HNMT基因的阳性表达率无差异(P>0.05)。但三者HNMT基因mRNA平均表达量间的差异性显著(P
