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【摘要】 目的了解大鼠热休克蛋白70(HSP70)的表达及肺组织病理改变与急性黄磷及其化合物吸入致急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)的关系。 方法 健康SD大鼠48只随机分为对照组以及造模后0、4、12、24、48 h处死组,每组8只。采用自制的气体发生以及染毒装置,将大鼠置入染毒柜后,间歇染毒形成ALI/ARDS模型。观察ALI/ARDS大鼠动脉血气分析变化和肺系数,肺组织HSP70的表达以及肺组织病理改变。 结果 肺损伤后大鼠动脉血气以及肺组织病理改变明显恶化,肺系数较对照组明显增大,正常大鼠肺组织HSP70表达较弱,表达部位为肺泡上皮和部分支气管黏膜上皮细胞胞质;在ALI/ARDS条件下,大鼠肺组织HSP70表达逐渐增强,至成模后12 h时相点,HSP70的表达最强,并呈现明显核表达;至成模后48 h时相点,HSP70的表达逐渐减弱,核表达逐渐消失,主要在肺泡上皮和部分支气管黏膜上皮细胞胞质表达。 结论 急性黄磷及其化合物吸入致ALI/ARDS大鼠肺组织病理改变随造模后时相的延长越来越严重。ALI/ARDS条件下大鼠肺组织HSP70表达表现为:受到应激-高表达-表达减弱,并伴有HSP70的再分布。
【关键词】 黄磷;急性;ALI;ARDS;大鼠; 病理改变; HSP70
The changes of the expressions of heat stress protein-70 and pathology in lung tissues of ali/ards induced by aspirating yellow phosphorus and its compounds in rats
GAO Jing,LIANG Xian-quan, ZHANG Cui-juan.
Weihai Municipal Hospital Shandong,Weihai 264202,China
【Abstract】 Objective To study the relationship between the expressions of heat stress proteins 70(HSP70) and the changes of pathology induced by aspirating yellow phosphorus and its compounds in rats. Methods 48 healthy SD rats were divided randomly into a matched control and build the model of ALI/ARDS made in 5 groups according to different hours(0,4,12,24 and 48 h respectively).Placing the rat into a poisonous cabinet, intermittent dye poison formation ALI/ARDS model. Observe the arterial blood gas analysis and the lung coefficient, , the expressions of HSP70 and pathology of lung organization in rats. Result The changes of pathology and the arterial blood gas analysis became worsen after stimulation. The lung coefficient compared with the matched control enlarge obviously, In the normal control group, the expression of HSP70 in rats’ lungs was not intensive, which could be only seen in cytoplasm of pulmonary alveolus epithelium cells and bronchial epithelium mucosa cells. ALI/ARDS increased HSP70 level, and the total content of HSP70 came to a peak level at 12 h after stimulation, while apparent expression of HSP70 in nucleus could be seen. At 48 h after stimulation, the content of HSP70 decreased and its expression in nucleus could not be seen. Conclusion The content of the changes of pathology increased with the phase after stimulation induced by aspirating yellow phosphorus and its compounds in rats. The expressions of HSP70 in ALI/ARDS performance is: stress reaction-high expression-low expression, with the redistribution of HSP70.
【Key words】 Yellow Phosphoru;Acute ALI;ARDS;Rat;Changes ofPathology;HSP70
急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI / ARDS)是由心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭。热休克蛋白(HSPs)是一组分子量不等的酸性蛋白。实验研究表明,HSP对ALI/ARDS具有保护作用[1,2],笔者模拟黄磷厂工人生产环境,建立大鼠急性黄磷及其化合物吸入致ALI/ARDS模型,探讨此状态下HSP70对ALI / ARDS的保护机制。
基金项目:贵州省优秀科技教育人才省长基金资助项目(200773号)
作者单位:264202威海市立医院(高婧 张翠娟);贵阳医学院附属医院(梁显泉)
1 材料与方法
1.1 材料 黄磷(贵州开阳磷矿厂提供);氢氧化钠固体(上海制药厂);地塞米松(5 mg/ml,贵阳医学院附属医院提供);仪器:血气分析仪(i-STAT型,美国);染毒柜(贵阳医学院设备科定做);电子天平(TYPE GB303,日本);兔抗大鼠HSP70免疫组化试剂盒(博士德公司);DAB显色试剂盒(博士德公司);Biomias99图像分析系统;动物:健康SD大鼠48 只,雌雄各半,体质量180～220 g(贵阳医学院实验动物中心提供)。
1.2 动物模型建立及分组
1.2.1 动物模型的建立 各组大鼠除对照组外,均参考文献方法[3,4],采用周身暴露式染毒,建立大鼠急性吸入黄磷及其化合物中毒致ALI/ARDS模型,具体步骤为:将50 g黄磷,50 g氢氧化钠放入盛有200 ml 50℃水的 1000 ml烧瓶中加热。染毒柜为30 cm×40 cm×50 cm,内置气体混匀装置,染毒柜下方开一直径1.5 cm孔,经橡皮管连接烧瓶。加热30 min后,见染毒柜中充满毒气,迅速拉开盖子,将一个时间点5只大鼠置入。染毒10 min,将大鼠取出,呼吸空气5 min,再置入染毒柜10 min。同法染毒6次,间隙5次,染毒方式为10-5-10-5-10-5-10-5-10-5-10(min)。总染毒时间为60 min,整个染毒过程中,各装置均持续工作。对照组采取类似方法,但无气体发生(不放入产气原料)。染毒后,将大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4 ml/kg)麻醉,选择一侧颈总动脉抽血作血气分析,动脉血氧分压(PaO�2)低于60～65 mm Hg时,既视为造模成功。
1.2.2 动物分组
将健康SD大鼠48只(雌雄各半),适应性喂养3 d后,随机分为对照组以及造模后0、4、12、24、48 h处死组,每组8只。
1.3 检测指标
1.3.1 一般情况 造模后开始观察大鼠精神状态,呼吸,活动情况。
1.3.2 肺系数测定 以全肺湿重与该大鼠体质量之比即为肺系数。
1.3.3 肺组织病理检查 肺组织置同一固定液固定12～24 h,取右肺中叶组织,常规石蜡包埋、切片,用于HE染色、光镜观察。
1.3.4 肺组织HSP70免疫组化检测 病理切片经免疫组化常规处理后滴加小鼠抗HSP70抗体,滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,滴加试剂SABC,然后DAB显色,最后图象在显微镜下行光密度分析。
1.3.5 显微镜下光密度分析步骤 在40×10倍光学显微镜下,每张切片随机选取5个区域(视场),每个视场选取5个阳性表达区域测量平均光密度(光密度数值与HSP70表达程度成反比)。
1.4 统计学方法 所有数据用均数±标准差(x±s)表示,采用完全随机的单因素方差分析,用t检验比较各均数相差的显著性,以P0. 05差异无统计学意义、4 h组与对照组、12 h组与对照组、24 h组与对照组、48 h组与对照组进行比较P0. 05差异无统计学意义。看出:大鼠氧合指数总体呈下降趋势,4 h组以前氧合指数下降不明显;4 h组以后氧合指数下降明显。
2.3 肺系数测定(见表2)
表2
各组肺组织肺系数对比(x±s)
组别例数肺系数(%)
对照组80.6473±0.0667
0 h组80.7357±0.0536�▲
4 h组80.7823±0.0748�●
12 h组80.8157±0.0765�●
24 h组80.8895±0.0586�●
48 h组80.9273±0.0980�●
注:与对照组比较,�▲P0. 05,差异无统计学意义。看出:对照组光密度平均值最高;0 h有所下降;4 h更低;12 h达最低点;24 h有所上升,大致与4 h组相当;48 h组又有升高,大致与0 h组相当。
2.6 肺组织HSP70免疫组化图像(见附图3-8) 随染毒时间延长,支气管黏膜上皮细胞胞浆内以及肺泡上皮细胞胞浆内棕黄色颗粒逐渐增多,部分支气管黏膜上皮细胞胞核内可见棕黄色颗粒。
3 讨论
急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS),由于肺泡-毛细血管膜的损伤,通透性增加和肺泡上皮细胞的损伤导致渗透性肺水肿,最终造成弥散功能障碍。其病因、机制至今尚不清楚,其治疗尚无突破性的进展。其病死率甚高,被公认为临床上最具挑战性的课题之一。
黄磷厂工人作业中,急性吸入黄磷及其化合物中毒致ALI/ARDS多见,病死率较高,本实验通过模拟黄磷厂工人中毒环境,建立大鼠急性黄磷及其化合物吸入中毒致ALI/ARDS模型,造模后大鼠呼吸费力,鼻唇发绀,呼吸加快,部分口鼻处可见血性分泌物,其血气改变,病理变化都达到ALI/ARDS的诊断标准[5]。
黄磷及其化合物急性吸入对机体各系统均有一定的损害,而最主要的方面表现为呼吸系统损害,从临床病例来看,患者有呼吸窘迫、发绀、烦躁、顽固性低氧血症等呼吸系统受累表现;从动物实验来看,对动物整体活动尤其是呼吸系统有明显影响,表现为呼吸急促、烦躁,口鼻腔分泌物增多等表现。病理见肺明显充血、水肿、点、片状出血、灶性肺不张,气管内有渗液,可见坏死脱落黏膜。光镜下见肺充血、出血、水肿、肺间质有炎细胞浸润,肺泡内见大量炎细胞、红细胞及水肿液聚集,部分可见透明膜形成,符合ALI/ARDS病理表现。从血气分析见氧分压在染毒后早期下降不明显,说明一开始染毒造成肺损伤炎症时,肺还有一个代偿期,动物通过呼吸速度加快,补偿氧交换的不足,当肺泡损伤达到Ⅱ型细胞破损,大量炎症物质及红细胞渗出到肺泡时,肺泡失去代偿作用,故氧分压直线下降,染毒后晚期动物测得的氧分压明显低于早期组,动物表现典型的缺氧症状[6]。从肺系数指标可见染毒后不同实验组肺系数随造模成功后时相延长而逐渐增大,表明肺组织Ⅱ型细胞损伤越来越严重,到后期肺泡腔内除有炎症渗出物外,还有红细胞渗出,造成肺外观呈现典型的肝样变,也就是典型的“湿肺” [7]。从HSP70的表达强度见正常大鼠肺组织 HSP70呈基础表达,表达部位主要在肺泡上皮细胞及支气管上皮黏膜细胞的胞质。模型组大鼠肺组织HSP70表达明显增强,并伴随胞核的阳性表达。这也符合ALI / ARDS条件下肺组织HSP70的表达规律。
在黄磷及其化合物急性吸入致ALI/ARDS的应激反应中,HSP70表达趋势为:受到应激-高表达-表达减弱,并伴有HSP70的再分布。由HSP70的表达强度来看,当肺组织受到侵害时,机体启动保护机制,其中HSP家族起到重要作用,而其中以HSP70的表达最为典型。对照组大鼠肺组织中,可见肺泡上皮及支气管上皮黏膜细胞胞质呈棕褐色颗粒,为中等程度表达,平滑肌细胞无表达。实验组大鼠0 h相点主要表现为肺泡上皮及支气管上皮黏膜细胞胞质为主的阳性表达;在 4 h时相点,HSP70的表达强度增强,并有部分核表达;在12 h时相点,HSP70的表达最强,核表达较前明显;24 h时相点,HSP70的表达部位与表达强度和4 h时相点相比基本相同;至染毒后48 h,表达强度明显减弱,表达部位为肺泡上皮和部分支气管黏膜上皮细胞,表达强度和0 h时相点相比基本相同。这表明,在黄磷及其化合物急性吸入致ALI/ARDS的应激反应中, HSP70的表达趋势为:受到应激-高表达-表达减弱,并伴有HSP70的再分布。
HSP70对ALI/ARDS的保护作用机制体现在:抗炎症:HSP的抗炎症作用与其抑制核因子-κB (NF-κB)的活性,减少炎症介质产生,以及增加抗炎细胞因子IL-10的表达有关。体外研究及动物实验也表明,应激可显著提高血浆IL-10的水平,减轻内毒素引起的ALI/ARDS[8]。
抗氧化:研究证明,用转基因的方法诱导上皮细胞表达HSP70,可以减轻高浓度氧介导的蛋白氧化、脂质过氧化、中性粒细胞浸润和细胞凋亡,防止ATP耗竭,从而起到细胞保护作用[9-11]。目前认为,HSP可能通过如下机制产生抗氧化作用:①使氧化剂血红素蛋白耗竭,产生抗氧化剂一胆绿素、胆红素;②提高细胞内游离铁水平,使铁蛋白表达上调; ③提高细胞cGMP的基础水平[12]。
抗细胞凋亡: 目前认为,细胞凋亡增加是ALI/ARDS的发病机制之一,Koto等[13]报道,在体外,用二甲胂基诱导人肺泡上皮细胞表达HSP,可抑制肺泡上皮细胞凋亡。应用转基因技术,可以减少caspase-8介导的肺泡上皮细胞凋亡[14]以及高浓度氧引起的肺组织细胞凋亡指数[15]。因此,抑制肺组织细胞凋亡可以保护ALI/ARDS[16,17]。
由于许多炎性介质首先是在肺内产生和(或)被激活的,成为介导多脏器损伤的重要因素。而肺脏是产生HSP70的主要器官之一, HSP70在肺的保护方面具有重要作用。实验表明,在黄磷及其化合物急性吸入致ALI/ARDS的应激反应中,HSP70表达趋势为:受到应激-高表达-表达减弱,并伴有HSP70的再分布。
参 考 文 献
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