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【摘要】目的：确定适合我实验室实际条件的检测化疗药物对胃癌患者活检肿瘤组织的作用所使用的Ex vivo 动物模型，并拟定构建方法。方法：查阅近年来关于胃癌动物模型的文献，做一简单综述，总结目前胃癌动物模型的研究现状。结论：我实验室可以尝试构建异种原位移植的胃癌动物模型，并进一步尝试应用于化疗药物药效研究。
引言
随着分子生物学理论技术的日新月异，胃癌的基础研究也不断深入，但分子水平的结果仍缺乏说服力，肿瘤动物模型能够在生物个体水平模拟肿瘤发生、发展、转移的病理过程。建立一种成熟、可靠、可复制性强，能够最大程度模拟人类胃癌浸润、转移的胃癌动物模型有助于为胃癌发病机制、预防、治疗等领域的基础研究结果提供强有力的依据。现就目前胃癌动物模型的研究状况做一简单的综述。
1实验动物的选择
理论上所有哺乳类动物均能作为胃癌动物模型，但根据实际情况可选用的动物有鼠、犬、灵长类动物。
1.1灵长类动物是与人类高度同源的物种，但数量有限，难以成规模的用于动物模型的制备。
1.2犬的胃组织结构与人类相似，如果胃癌模型构建成熟，可以进行X线检查和胃镜检查随访，但其费用高，造模所需周期长，不易大批量的进行模型复制和重复验证，且对于异种移植成功率较小，没有成熟的免疫缺陷型动物难以广泛的应用。
1.3 实验用小鼠、大鼠与前两种相比具有费用低廉、体积小生命力强、易于饲养以及造模所需周期短等优点，广泛被用于生物学研究。其品系繁多，近交系、远交系、免疫缺陷型、基因敲除型种类完备，目前用于各种胃癌动物模型的建立。
1.3.1诱癌率较高的wiste大鼠常用于诱发型的胃癌动物模型。
1.3.2蒙古沙土鼠因自然感染胃炎概率小,存活期长于小鼠,感染人幽门螺旋杆菌后易出现胃部的组织学病变,所以适宜于幽门螺旋杆菌感染的胃癌模型建立[1]
1.3.3 裸鼠因先天缺乏胸腺, T细胞免疫功能接近于零,所以人体肿瘤异种移植时无排斥反应,移植后肿瘤仍保持其原有的组织形态、免疫学特点、特有的染色体组型以及对抗肿瘤药的原有敏感性。因裸鼠培育条件低,无毛,易于动态观察肿瘤的生长状态,且通过接种方式、部位的选择可达到较满意的转移效果,因此目前多选择裸鼠进行人胃癌细胞异体移值。[2]
2建模方法的选择
2.1 诱发型胃癌动物模型
2.1.1 致癌化合物诱导建立的胃癌动物模型：亚硝基化合物是目前公认的胃癌发生的主要原因之一。胃对它的转化失活能力最差，经胃粘膜吸收渗透至胃幽门部和胃底黏膜后，通过直接破坏胃组织细胞DNA,而诱发胃癌，具有特异性和较强的致癌力。另外日本最早报道应用N-甲基-N′- 硝基-N-亚硝基胍喂养Wistar雄性大鼠可以成功直接诱发大鼠胃腺癌。
通常使用单一诱导的实验持续时间长,癌变率也较低,其成瘤率受到给药方式、持续刺激时间长短、致癌物浓度等因素的影响。为使胃癌动物模型的建立更加有效，目前多采用多种致癌因素联合诱导。如应用硝酸、醋酸、乙醇、胆汁等或于幽门环处埋置金属弹簧造成十二指肠液反流、胃部分切除术等能损伤胃黏膜的理化刺激致溃疡后再结合N2甲基2N′2 硝基2N2亚硝基胍攻击大鼠,使N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍更好地作用。
2.1.2 幽门螺旋杆菌感染致胃癌的动物模型：1998 年第一例幽门螺旋杆菌株感染蒙古沙土鼠诱发胃癌成功,首次在实验动物上直接证实了幽门螺旋杆菌与胃癌发生有关。[3]
幽门螺旋杆菌是各种慢性胃病的重要病因,人或动物感染幽门螺旋杆菌后,发生急慢性炎症,损伤胃壁上皮细胞,最后使胃细胞突变,导致胃癌。对这一过程的研究已基本上取得共识,但仍有许多环节机制不明,其相关动物模型有待进一步研究。
单独用幽门螺旋杆菌感染法主要缺点是诱发胃癌周期长,所以目前国内外多用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍等致癌剂与幽门螺旋杆菌共同作用建立模型。
2.2 移植建立的胃癌动物模型：
2.2.1按照移植组织的来源可以分为同种移植和异种移植，将诱发胃癌小鼠的肿瘤组织或肿瘤细胞悬液移植到同品系小鼠体内为同种移植，将人类胃癌组织或者是人类胃癌细胞系移植到小鼠体内为异种移植。目前两种移植方式均有报道，但是成瘤率不是特别理想，随着裸鼠等免疫缺陷小鼠的应用，成瘤率得到明显提高。
2.2.2按照移植的部位可以分为异位移植和原位移植，异位移植采取的方法有小鼠背部、腋下部的皮下接种以及腹腔注射。其操作简单、肿瘤位置表浅便于观察记录大小的改变，且建模周期短，故是目前国内应用最广的胃癌动物模型。但是这种方式改变了肿瘤生物学行为和自然属性，使实验结果与人类肿瘤细胞移植生长和转移的自然过程不够吻合，且由于局部纤维组织的包裹较少发生远处转移。[4]
原位移植即将肿瘤细胞或组织块直接移植到鼠的胃壁上，这种方式建立的胃癌模型最符合肿瘤的生物学行为和自然属性，并具有人胃癌自然生长过程的特点，证实肿瘤种植的恶解剖部位对肿瘤细胞的转移行为有重要影响。[5]
原位移植的方式有胃癌细胞系胃壁下注射、组织块胃壁缝挂法、胃壁缝制粘膜小囊包埋法、胃壁生物胶粘合法。
2.2.2.1日本学者Furukawa等最早尝试将完整组织块原位缝挂裸鼠胃壁比肿瘤细胞悬液原位移植裸鼠胃壁后转移率高，[6]汪芳裕等在裸鼠胃壁缝制粘膜小囊包埋肿瘤组织块,这种模型肝脏转移率、腹水形成率较高，[7]但是传统的完整组织块模型无论是缝挂法还是胃囊法又存在许多造模时的实际困难和弊端，如造模时间长、 缝针时出血量较多、死亡率较高等，从而导致造模成功率相对不高。
2.2.2.2为最大程度的减小鼠造模过程中的创伤、简化造模程序、缩短造模时间，提高成瘤率，降低鼠的死亡率，国内陈亚琳等报道用生物胶将瘤组织块粘贴于裸鼠胃壁，简便易行，能完整地重现胃癌的临床转移过程， 成功地建立了一种有价值的胃癌转移模型。[8]
3选用的移植物
3.1 肿瘤细胞系悬液：目前的胃癌肿瘤细胞系均为人的胃癌组织经原代培养得来，能够稳定传代并具有各异的生物学性状，因此其与人胃癌组织具有较大的同源性，但是在若干次的传代过程中发生了一系列的变异，与人胃癌组织又有一些生物学行为的差别。细胞悬液可以直接采用体外细胞培养的细胞，也可以将癌组织研磨、酶消化取得。采用细胞悬液造模无论原位还是异位，其操作都较组织块简便，但也有其弊端，细胞悬液缺乏一定的组织结构，需要严格控制悬液的细胞浓度，且细胞表面的一些抗原、受体经酶等作用后会发生缺失，影响其与移植部位局部微环境的相互作用。
3.2肿瘤组织块：可以取自小鼠自发或异位移植后成功生长的肿瘤，也可以取自胃癌患者手术标本或胃镜等检查手段的活检组织。经去除坏死组织、漂洗、滤纸吸干等处理后置于缓冲液中剪成1-2mm大小的微小组织块，再接种于小鼠体内。与细胞悬液相比组织块保持了癌组织的完整结构，原位移植成功率、转移率等较癌细胞悬液高，但其操作相对复杂，无论采用缝挂法、胃粘膜小囊法还是生物胶粘帖法都不能避免胃壁的损伤和出血，小鼠体积小，微小的出血量都会严重影响动物模型的存活时间、生存率，从而影响成瘤率。
4常用的胃癌动物模型
4.1应用诱导剂建立动物模型：诱导剂多采用亚硝基化合物及其前体物以及N-甲基-N′- 硝基-N-亚硝基胍等目前已明确致癌作用的化合物。诱导方法有口服法、灌胃法和胃黏膜挂线法等。目前多用口服法,即将药物掺入饲料或饮用水中让动物自由服用。此法操作简便,排除了对胃的某些非特异性损伤,模型与人胃癌的自然发生机制相似,但饮用剂量难以精确掌握。此模型与临床胃癌及癌前病变的发病机制更为接近,周期短,癌发率较高,但动物的病死率升高是其缺点[9]
4.2幽门螺旋杆菌感染动物建立模型：人工导致小鼠感染幽门螺旋杆菌，产生小鼠发生急慢性胃炎,损伤胃壁上皮细胞,最后使胃细胞突变,导致胃癌。单独用幽门螺旋杆菌感染法主要缺点是诱发胃癌周期长,所以目前国内外多用N2甲基2N′2 硝基2N2亚硝基胍等致癌剂与幽门螺旋杆菌共同作用建立模型。
4.3利用细胞株建立动物模型：移植物采用癌细胞悬液，主要方法为皮下接种、腹腔注射和原位种植[10]。其中皮下接种和腹腔注射操作简单、肿瘤表浅、便于观察且潜伏期短,常被应用于胃癌的动物模型建立[11]。但由于裸鼠的饲养条件、种植肿瘤细胞的数量及状态等影响因素,成瘤率不是很高,有时种植瘤形成后很快就发生出血及坏死。而原位种植则特异性高、定位准确、成瘤率高,但操作困难。所以在必要时可以同用3种方法来实现模型的建立。
4.3.1利用动物自发瘤建立瘤株许多动物皆可自发产生肿瘤,其中小鼠自发瘤在组织学和来源方面与人类肿瘤有相似之处,应用较多,按具体需要利用自发瘤移植于同种系动物可得到移植性肿瘤[12]。
4.3.2免疫缺陷动物的移植模型将人类肿瘤组织或细胞直接接种于裸鼠进行免疫遗传研究方法逐渐成熟,此方法经历了3个发展阶段: ①癌细胞悬液皮下接种。本法适用于成活率高的移植瘤接种实验。接种部位以腋窝和鼠蹊部为佳,特别是腋窝皮肤松弛能使肿瘤长得较大,宿主寿命也较长。但这种方式改变了肿瘤生物学行为和自然属性使实验结果与人类肿瘤细胞移植生长和转移的自然过程不够吻合,且较少发生远处转移[4] 。②癌细胞悬液原位接种。在所有的植入途径中,原位移植最易发生类似人类肿瘤的转移过程,因此而形成人类癌转移模型的原位移植技术,即用癌细胞悬液种植于裸鼠胃壁而成[5]。如陶凯雄等[13]用Walker2256 (肉瘤)细胞株接种于纯系Wistar大鼠胃壁,成功地复制出种植性胃癌模型,并具有人胃癌自然生长过程的特点,证实肿瘤种植的解剖部位对肿瘤细胞的转移行为有重要影响。该模型仍不能达到理想的肿瘤移植转移模型标准,如原位成瘤率和转移率尚不能令人满意。可能是肿瘤细胞经酶消化处理后,细胞表面结构遭破坏,发生了变化,导致恶性肿瘤生物学行为和自然属性改变,影响了肿瘤细胞的生长与转移。③完整瘤组织块原位接种,又称转移鼠模型,它既有原位移植的优点,又保持癌组织的完整结构,所以原位移植成功率、转移率、荷瘤鼠中位生存期等指标皆优于前二者,能更好地模拟临床肿瘤发生、发展过程,具体方法是将人胃癌细胞株裸鼠皮下移植瘤或者腹腔接种反复传代后,以组织块为材料,将其移植到手术制备的裸鼠胃黏膜小囊中。该模型胃癌主要通过淋巴道转移,后期出现血行转移,最能代表胃癌的浸润转移特点,可作为人胃癌实验研究的理想工具。
4.3.3免疫正常动物的移植模型裸鼠因价格等因素尚难推广,人们致力研究免疫正常动物体内移植人类肿瘤模型。该模型可用于研究胃癌腹膜转移机制、生物学行为以及治疗效果,缺点是免疫功能影响成瘤率,故只适应于实验周期较短的实验。
4.4应用转基因法建立动物模型转基因胃癌模型是直接将调控胃癌的相关基因转染到动物胚胎中而形成肿瘤,如转染了腺病毒12Ela /Elb的大鼠,在扁平上皮和圆柱形上皮的结合点附近形成了类似人胃癌[14];用癌胚抗原促进剂SV40T抗原经转基因构建的胃癌小鼠, 癌肿位于幽门部, 传代成瘤率达100%。[15]
转基因动物形成肿瘤的形态特征与人自然发生的肿瘤极为相似,且肿瘤只发生在特定的组织内,特异性很高。转基因动物在胃癌形成、发展机制研究中有独特的优势,如探讨化学药物与基因蛋白表达产物、幽门螺旋杆菌等在胃癌形成中的相互作用,转化生长因子α抑制剂在核因子κB信号转导通路中的作用等,是一种较为理想的胃癌模型[ 17219 ] 。随着分子生物学的高速发展,载体、受体、基因导入等技术不断成熟,转基因法将成为未来胃癌模型制作的
主要方向。
5结论
成熟、可靠的胃癌动物模型对胃癌发病、侵袭、转移机制的研究以及抗癌药物药效的前期试验具有重要的意义。理想的胃癌动物模型至少应有以下一些特点中的部分或全部：①方法简便易行; ②成本低，造模周期短; ③实验观察指标易于观察测量; ④具有较高的器官特异性; ⑤可重复，实验结果稳定; ⑥动物模型的胃癌与人胃癌的病理类型、生物学行为、镜下表现及组织化学改变等相似。
当然，各种模型都有其利和弊，胃癌动物模型的选择应根据应根据每个试验室的实际情况、研究的方向、目的而定。如研究胃癌的发病学机制,多采用药物诱导剂的方法,研究胃癌的浸润转移、筛选抗癌药物、验证可疑致癌因子作用、研究病因学及肿瘤发病学、生物学特性时最常应用的是人胃癌细胞株裸鼠移植法。目前较多的是将几种方法有机结合共同建立模型,此法效果和效率皆优于单一方法,更符合实际情况。胃癌模型研究无论在模型的建立和检测上均未达到理想的程度,如果能人工控制,活体动态检测,跟踪观察各种促癌和抑癌因素作用,则能大大提高其研究应用价值。
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