【www.zhangdahai.com--保证书】
[摘要]目的建立消风散中欧前胡素的含量测定方法。方法采用反相高效液相色谱法测定含量。色谱柱:UltimateXBC18柱;流动相:甲醇-水(66:34);流速:1.0ml/min;检测波长:300nm。结果:欧前胡素在3.64～36.4μg/ml范围内与峰面积成良好的线性关系(r=0.9999);平均加样回收率为99.8%,RSD=1.14%(n=5)。结论本法灵敏、准确,重现性好,可作为消风散中欧前胡素的含量测定。
[关健词]RP-HPLC;消风散;欧前胡素;含量
消风散是经河南省食品药品监督管理局批准的中药复方医院制剂,由白芷、荆芥穗、防风、紫苏叶、葛根等药物组成,具有祛风解表的功效,其质量标准中没有含量测定。白芷为方中君药,欧前胡素是白芷中重要活性成分[1],我们参考文献[2-3]采用反相高效液相法对欧前胡素的含量进行了测定,具有分离度好、重现性好、灵敏度高的特点,可以有效的控制该制剂的含量。
1仪器与试药
岛津高效液相色谱系统:LC―10ADVP输液泵,SPD―10AVP紫外检测器,进样阀10μl定量环,CTO―10ASVP柱温箱。色谱柱:KromasilC18(Φ4.6mm×250mm,5μm)。工作站:CS―Light色谱工作站。Preser92SM―202A―DR电子分析天平。欧前胡素对照品(购于中国药品生物制品检定所,批号:100826-200511);消风散(平顶山市中医医院制剂室,批号:20081201,20081217,20081229);甲醇为色谱纯;水为纯净水;其余试剂为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件KromasilC18(Φ4.6mm×250mm,5μm)色谱柱;流动相:甲醇-水(66:34);SPD―10AVP紫外检测器;检测波长:300nm;进样量:10μl;流速:1.0ml/min柱温:30℃;欧前胡素与样品中的其他成分峰的分离度R>2.0。
2.2溶液制备[2]
2.2.1对照品溶液的制备精密称取欧前胡素对照品9.1mg,置50ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品贮备液(含欧前胡素182μg/ml);再精密量取贮备液3ml,置25ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成对照品溶液(含欧前胡素21.84μg/ml)。
2.2.2供试品溶液的制备取本品约1.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50ml,密塞,称定重量,超声处理(功率300W,频率50kHz)45min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得供试品溶液。
2.2.3阴性对照溶液的制备按处方比例及工艺,制备缺少白芷的阴性样品,再按供试品溶液的制备方法制备不含欧前胡素的阴性对照溶液。
2.3线性关系考察精密量取上述对照品贮备液1,2,3,3,5ml,分别置50,50,50,25,25ml量瓶中,加甲醇稀释成5个等差浓度(3.64～36.4μg/ml),各取10μl重复进样(n=3),记录色谱图。以吸收峰面积Y为纵坐标,以欧前胡素进样量X为横坐标,绘制标准曲线,得线性回归方程Y=0.000714631X+1.1516,r=0.9999(n=5)结果表明欧前胡素在0.0364～0.3640μg范围内进样量与峰面积积分值之间线性关系良好。
2.4精密度试验取对照品溶液,重复进样5次,每次10μl,测定其峰面积,结果欧前胡素峰面积的RSD=0.31%(n=5),表明精密度良好。
2.5稳定性试验取同一批号供试品溶液,分别在0,3,6,9,12h连续进样5次,进样量10μl,测定峰面积,RSD=1.21%,表明供试品溶液在12h时间内稳定。
2.6重复性试验分别取同一批号供试品1.0g5份,分别照供试品溶液制备方法制备供试品溶液,在上述色谱条件测定含量,RSD=1.23%,结果表明重复性良好。
2.7干扰试验分别精密量取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μl,按上述色谱条件分别进行测定,欧前胡素与其他组分的分离度R>2.0,阴性对照无干扰,见图1。
2.8回收率试验精密称取已知欧前胡素含量的样品(批号20081201)5份,分别加入对照品储备液1.0ml,按供试品制备方法制备供试品溶液。并按上述色谱条件进行测定,计算平均回收率为99.8�,RSD=1.14�,说明该含量测定方法可行。
2.9样品含量测定取不同批号样品三批,照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,照上述色谱条件进样10μl,分别测定峰面积,按外标峰面积法计算欧前胡素含量,三批样品含量分别为0.092%、0.092%、0.089%。
3讨论
3.1中药制剂多为复方,成分较复杂,进样前需加适当处理。该制剂有5味药组成,试验中曾经采用甲醇超声30、45、60min提取;30%乙醇回流30、60、90min提取;经过考察提取效果,结果表明用超声直接处理,简便易行、欧前胡素提取较完全,经比较约为回流提取所测数值的1.5倍;比较超声提取时间以45min提取效果最佳,故选择超声提取45min。
3.2流动相的选择曾经选用多个流动相,不同比例的甲醇-水,乙腈-水,甲醇-水-乙酸胺,结果以甲醇-水(66:34)的峰形及分离效果最好、主峰保留时间较短。可使样品中欧前胡素与相邻的色谱峰分离,获得较好的峰形。
3.3检测波长的选择取欧前胡素对照品溶液进行紫外扫描(200～400nm),结果在220、260、300nm处都有最大吸收,但在300nm附近无干扰峰。故选择检测波长为300nm。
3.4根据《中国药典》2005年版一部白芷药材含量测定项下规定的欧前胡素限度及该制剂处方与制法,样品中欧前胡素的含量应不得低于0.120mg/g。从样品测定结果来看,不同批号含量均未达到最低限度。可能与中药复方影响有效成分提取有关,有待进一步研究更加高效简捷的提取方法。
