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[摘要]目的探讨姜黄素对肿瘤血管形成抑制作用机制。方法通过建立动物肿瘤模型,运用分别实验治疗,结合免疫组化,检测其肿瘤内血管密度以及瘤体Ang-2和HIF-1α的表达。结果姜黄素中剂量和大剂量姜黄素组的S180瘤体内微血管密度均明显低于对照组;免疫组化显示中剂量和大剂量姜黄素组可抑制S180瘤体内Ang-2和HIF-1α的表达。结论姜黄素对小鼠S180肉瘤血管形成有明显抑制作用,降低Ang-2和HIF-1α的表达可能是其抑制肿瘤血管形成的主要机制之一。
[关键词]姜黄素;血管生成素-2;缺氧诱导因子-1α
姜黄是姜科植物(CurcumalongaLinn)的根茎,属于活血化瘀药,始载于《新修本草》,具行气滞、散风活血而止痛之功效。姜黄素是姜黄的主要成分,其主要药理作用有抗炎、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗脂质过氧化等[1]。姜黄素的抗肿瘤作用日益引起人们的重视,已成为肿瘤预防和治疗的一个研究热点。我们从血管形成抑制的角度,对姜黄素抗肿瘤的作用机制作了进一步的研究。
材料与方法
1实验动物及瘤株
昆明小鼠72只,雌雄各半,6~8周龄,体质量(20±2)g,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。小鼠肉瘤S180细胞由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。
2药品
姜黄素购自sigma公司,纯度97%。
3方法
3.1荷瘤鼠模型的建立
小鼠肉瘤S180瘤株,腹腔传代接种。待腹水生长旺盛时,抽出腹水,细胞计数,调整细胞浓度为107个细胞/ml,在小鼠腋下皮下注射S180肉瘤细胞,每只接种0.2ml。
3.2治疗及分组
60只小鼠于接种当天随机分为4组:随机分为空白组、姜黄素低剂量(40mg/(kg•d))组、姜黄素中剂量(80mg/(kg•d))组、姜黄素高剂量(160mg/(kg•d))组,每组各15只。姜黄素组每天予以姜黄素相应的剂量灌胃。治疗10d后处死小鼠,剥离瘤体。接种成瘤率为100%。
3.3微血管染色
免疫组化SABC法染色血管,微血管染色试剂盒(一抗为人相关第八因子)为武汉博士德生物公司产品。大剂量各组和对照组瘤体剥离后,切取标本,固定,包埋,切片。经染色后的切片,内皮细胞褐染,血管呈黄褐色,易于辨认。MVD的测定按Bosari等[2]报道的方法进行,先在低倍视野下选取肿瘤微血管最丰富的区域,既“热点”,再在400倍视野范围计数被染成棕色的微血管数目,取3个数值的平均值作为MVD值。任何棕染的内皮细胞或内皮细胞簇,只要与临近的微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开,就视为一个血管,尽管血管腔常可看到,但并不作为判断血管的标准。为了避免较大血管对计数的干扰,对管壁有较厚平滑肌包绕或管腔>8个红细胞面积的血管不予计数。
3.4Ang-2和HIF-1α免疫组化
Ang-2和HIF-1α免疫组化检测试剂盒购自武汉博士德生物公司。各组瘤体剥离后,切取标本,固定,包埋,切片。按照试剂盒说明操作。阳性细胞呈棕黄色,免疫组化染色评分按Rahman等[3]的方法进行,即Ang-2和HIF-1α的评分标准是:根据着色细胞的比例(染色范围)及染色强度,染色范围(阳性细胞比率)分为0～4级,阴性为0;阳性细胞1%～25%为1;阳性细胞26%～50%为2;阳性细胞51%～75%为3;阳性染色76%～100%为4。染色强度划分为0～3级:阴性为0;弱阳性为1;中等强度为2;强阳性为3。
4统计方法
运用SPSS统计软件,采用t检验。
结果
1姜黄素对S180瘤体微血管密度的影响
经免疫组化SABC法染色后的切片,血管内皮细胞被褐染,对照组可见微血管广泛分布于肿瘤间质内,实验组微血管相对少见。各组小鼠移植瘤内微血管密度,结果见表1。
2各组对S180瘤体Ang-2和HIF-1α表达的影响
免疫组化结果显示,Ang-2和HIF-1α蛋白在S180肉瘤组织中呈高表达,主要表达于细胞的细胞质。中剂量和大剂量姜黄素对Ang-2和HIF-1α的表达具有抑制作用,其中以大剂量组作用最明显。结果见表2。
讨论
祖国医学认为“久病必瘀”,肿瘤患者临床多出现血瘀症候,活血化瘀是治疗瘀症的主要方法。目前人们正致力于开发和研究能抑制血管生成从而有效地阻止肿瘤生长和转移的药物。常用活血化瘀药姜黄是抗肿瘤复方常用药,其主要有效成分―姜黄素(curcumin)在防治肿瘤等方面有明显作用,在抗肿瘤方面具有很好的发展前景[4],美国国立肿瘤所已将其列为第三代癌化学预防药。
缺氧诱导因子-1α(HIF-lα)表达增加可使肿瘤血管形成相关基因表达升高,包括血管内皮生长因子(VEGF)、纤维生长因子(FGF)、转化生长因子α(TGFα)等,VEGF在肿瘤血管行程中起关键作用[5]。目前的研究表明:在缺氧时调节VEGF的信号传导途径中,HIF-1起中枢纽带作用,它的功能不仅使VEGF的mRNA稳定性增加,而且能增加VEGF的转录活性[6]。HIF-lα对肿瘤血管的形成具有明显的促进作用。
血管生成素-2(Ang-2)的表达是肿瘤血管新生起始及加强的关键因素之一,与肿瘤血管形成的数目、临床分期、预后关系密切[7]。Ang-2在肿瘤组织中的表达明显高于周围正常组织,且特异表达于肿瘤边缘的血管重建区[8],参与肿瘤新生血管的形成、延续,影响肿瘤的生长、转移。设计针对Ang-2的干预,已经成为预防肿瘤转移的潜在治疗靶点。
本实验通过小鼠移植性肿瘤模型体内实验,瘤体微血管标记染色,微血管密度计数显示,姜黄素可抑制肿瘤血管的生成。姜黄素抑制肿瘤形成的机制时发现,姜黄素可下调Ang-2和HIF-1α蛋白的表达。由此可见,姜黄素具有抑制肿瘤血管形成的作用,其作用机制可能是下调Ang-2和HIF-1α的表达。
以肿瘤血管生成为靶点开发血管生成抑制剂在抗肿瘤研究中是一个新的十分活跃的研究领域。很多血管生成抑制活性药物在抑制血管生成的同时,也产生了很多严重的毒副作用。因此,从天然药物尤其是传统中药中寻找安全有效的肿瘤血管生成抑制剂,已成为当前肿瘤药物研究开发的一个重要方向,抗肿瘤血管生成的中药研究开发将会越来越受到更多的关注。
