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【摘要】 目的 探讨兔急性脊髓损伤后应用大剂量甲泼尼松(methylprednisolone)干预基质金属蛋白酶-2、12(MMP-2、12)表达及神经功能的影响。方法 家兔随机分为急性脊髓损伤后应用生理盐水对照组(A组)和应用甲泼尼松治疗组(B组),损伤后不同时间点取材,用HE染色观察损伤脊髓组织病理变化;用免疫组化染色检测MMP-2及Real-Time PCR检测MMP-12的表达变化;采用Tarlov评分评价神经功能。结果 HE染色镜检发现脊髓组织病理学改变B组明显轻于A组。A、B两组均发现MMP-2、12的表达,MMP-2、12表达A组>B组(P 1.5.2 实施荧光定量PCR 按照试剂盒说明操作,①通过逆转录将样品RNA转变为cDNA;②制备标准曲线样品:进行相对定量,需要将样品的目的基因及管家基因进行PCR 扩增,其产物进行梯度稀释用于做标准曲线;③将标准曲线样品与待测样品分别假入到Real-Time PCR反应液中,进行Real-Time PCR 扩增与检测;④检测结果进行标准曲线分析。
1.6 HE染色病理学观察 对假手术组及损伤组在损伤后按时间点进行脊髓取材,取材部位应在打击中央,以4%多聚甲醛固定,梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋,4 μm连续切片,将做好的切片按以下顺序脱蜡:(1)二甲苯(2～3 min)→二甲苯(2～3 min)→二甲苯(2～3 min);脱过蜡的切片再按以下顺序用乙醇洗去二甲苯:无水乙醇→无水乙醇→95%乙醇→80%乙醇→蒸馏水;(2)苏木素中浸泡5 min,用蒸馏水冲洗,放入盐酸乙醇中浸泡20 s,用蒸馏水冲洗,再放入蒸馏水中浸泡15 min;(3)伊红染色1 min,依次在75%、80%、95%及无水乙醇中浸泡1 min。用中性树脂封片,晾干。
1.7 改良Tarlov评分法实验动物在术前1 h,术后麻醉清醒后6 h,损伤后24 h,48 h、7、14 d各组取5只放于开阔空间内观察动物双后肢运动功能。(采用改良Tarlov评分法,标准为:0分:完全瘫痪,针刺下肢无反应。1分:完全瘫痪,针刺下肢有反应,但肢体不能活动。2分:肢体可活动,但不能站立或站立不稳。3分:可站立,但无法行走。4分:可行走数步,但不能稳定。5分:能缓慢行走,但不灵活。6分:正常行走。)
1.8 统计学方法 SPSS 12.0软件进行统计分析,血清中MMP-2、12含量及组织PCR 荧光定量CT值与细胞阳性表达率采用两样本t检验或t’检验,设α=0.05为检验标准。
2 结果
2.1 行为学观察 见表1,A、B二两组改良Tarlov评分在伤后24 h内三组评分比较无显著性差异(P>0.05),B组同时间点的评分高于A组,B组在损伤后48 h运动功能恢复较A组明显改善,A、B两组间比较差异无统计学意义(P>0.05),伤后7～14 d比较两组间差异具有统计学意义(P0.05,表示差异无统计学意义;�#P
3 讨论
1911年Allen提出ASCI后分为原发性损伤和继发性损伤两个阶段的理论,成为ASCI治疗理念的里程碑,由于原发性损伤的不可逆性因此此后的研究主要针对第二阶段,即继发性损伤的病理生理及其干预手段。
MP是一种合成的糖皮质激素类免疫抑制剂,由于其携带个甲基,它的脂溶性大大提高,穿透血脑屏障和细胞膜的作用大为增强,目前已广泛应用于临床中枢神经损伤急性期,对脑和脊髓损伤起保护作用。美国NASCIS曾经于20世纪80、90年代3次开展该药对ASCI的治疗研究,但3次结果均不一致,因此MP对神经系统的保护作用及其机制没有定论。多数学者认为其主要作用机理在于[1]:①MP具有很强的抑制脂质过氧化作用,中和氧自由基,防止神经细胞的凋亡,促进神经系统的复苏。伤后早期使用MP可抑制这种快速反应;②MP可维持细胞膜及细胞器膜的稳定性,维持细胞内外钙、钠、钾、氯等离子稳态平衡,以减轻神经细胞因离子代谢紊所造成的继发性损害;③MP可维持脊髓组织血流量及改善Na-K-ATP酶的功能,保护神经细胞的有氧代谢,使脊髓水肿得到改善。
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一组锌依赖的蛋白水解酶,具有降解多种细胞外基质成分,如胶原、层粘素、明胶、弹性硬蛋白、粘连蛋白及蛋白多糖等功能。因此它对需要基质重建的生理病理过程如生长发育、创伤愈合及修复起到重要作用[2]。现已知MMPs含有不同的底物,除降解细胞外基质外它们还具有多种功能,如调节生理机能、信号发出、血管发生、炎症反应及细胞运动[3,4],所以MMPs的不规则表达对多种疾病的病理过程的发生可起到通讯的作用,包括肿瘤转移、CNS损伤如多发性硬化症,脑卒中,人体免疫缺陷症病毒及创伤等。
MMP-2是由Huhtala P等人在1990年克隆表达的,其结构中含有信号肽、前肽、催化区、纤维连接蛋白样区域及血红素结合样区域。人类MMP-2基因编码分子量约72kd的酶原,经活化后水解为65kd的活性形式。MMP-2是降解细胞外基质骨架蛋白Ⅳ型胶原主要酶之一,MMP-2基因位于人类染色体16q21,由13个外显子和12个内含子所组成,结构基因总长度为27kb,与其他金属蛋白酶不同,MMP-2基因5’旁侧序列促进子区域含有2个GC盒而不是TATA盒。活化的MMP-2定位于细胞穿透基质的突出部位,其在酶解细胞间基质成分及基底膜的主要成分Ⅳ型胶原中有“钻头”的作用。正常成人组织中它的水平较低,只有在系统接受一个刺激或病理状态下其水平才会升高。通过第一部分实验可以看出脊髓损伤后MMP-2及MMP-12反应性的快速增高,且具有很强的时间依赖性。本实验通过MP对其干预,血清及组织检测结果显示C组(MP干预)在损伤后MMP-2及MMP-12的表达明显减少,24 h虽运动评分未见显著性差异,但已有明显好转,脊髓病理切片观察发现脊髓损伤8～24 h内水肿及出血程度与A组相比明显减轻。
对于MP下调MMP-2及MMP-12的表达及减轻脊髓继发性损伤的机制,作者认为:①MMP-12是由活化的巨噬细胞分泌的一种基质金属蛋白酶,它是巨噬细胞穿透基底膜和浸润组织必不可少的一种活性成分,众所周知,MP属糖皮质激素,治疗剂量的MP可抑制巨噬细胞的吞噬功能,MP通过下调MMP-2及MMP-12的表达抑制巨噬细胞的吞噬功能,进而减少巨噬细胞对周围组织的浸润;②ASCI后,早期的继发性刺激主要来源于炎性刺激,这主要因为一方面血脑脊髓屏障的开放导致外周血中白细胞、巨噬细胞浸润,另一方面是脊髓组织内炎症因子的产生,无论哪种刺激都涉及星形胶质细胞,因为星形胶质细胞是构成血-脑脊髓屏障的重要结构,因此MP通过下调MMP-2及MMP-12的表达进一步减少对血-脑脊髓屏障损害及减轻脊髓水肿。
综上所述:ASCI后早期应用甲泼尼松可下调MMP-2及MMP-12的表达,进一步减轻脊髓继发性损伤,这也可能是MP促进神经功能恢复的机理之一,但对于MP下调MMP-2及MMP-12表达的分子生物学机制仍需进一步研究。
参 考 文 献
[1] Hall ED.The neuroporotective pharmcaology ofmethylprednisolone.J Neurosurg,1992,76(1):13-22.
[2] Yong VW, Power C.Metalloproteinases in biology and pathology of the nervous system. Nat Rev Neurosci,2001,2: 502-511.
[3] Egeblad M,Werb Z. New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression. Nat Rev Cancer, 2002,2: 161-174.
[4] Webber CA.Metalloproteases and guidance of retinal axons in the developing visual system. J Neurosci 2002,22: 8091-8100.
