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[摘要] 目的 探讨分离高质量和高活性骨髓间充质干细胞的方法。方法 选取出生2月龄的健康兔,采用密度梯度离心分离法与贴壁分离法培养骨髓间充质干细胞,检测培养骨髓间充质干细胞生物学特性。结果 贴壁分离法培养的原代骨髓间充质干细胞贴壁增殖快,细胞活性高,而密度梯度离心分离法培养的原代骨髓间充质干细胞贴壁增殖慢,细胞活性低,但这些差别在传代后消失。离心分离法得到的细胞纯度较贴壁分离法获得的细胞纯度高。结论 与离心分离法相比贴壁法获得的原代骨髓间充质干细胞的细胞活性较高、贴壁增殖快,具有方法简单的优点。
[关键词] 骨髓; 间充质干细胞; 兔; 细胞培养
[中图分类号] R329.2+8 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)05-29-03
Effects of Adherence and Density Gradient Centrifugation Methods on Biological Characteristlcs of Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells Cultured in Vitro
LI Ting1 SUN Jinhu1 ZHAO Liang2 LI Shuai1
1.College of Stomatology,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China;2.The people’s Hospital of Hechi City,Hechi 546300,China
[Abstract] ObjectiveTo study the effects of adherence and density gradient centrifugation(DGC) methods on biological characteristics of rabbit marrow mesenchymal stem cells cultured in vitro. MethodsRabbits aged 2 months were used to isolate marrow mesenchymal stem cells(MSCs). MSCs with adherence and DGC methods were cultured,passaged,amplified and purified in vitro. The living characteristics and adhesive rate of the primary and generations were observed respectively. The growth curve was drawn. The cell cycles and cystoskeleton were tested to study the different MSCs separated methods on the proliferation and metabolism of MSCs. ResultsMSCs were intact and fibroblast cell-shaped. Adhering spindle-shaped cells with higher cytoactive were observed in the adherence and DGC separation groups. The MSCs of primary culture in the adherence group showed more rapid proliferation,earlier colony confluence and shorter time for passage compared with DGC separation group. ConclusionThe MSCs separated by adherence showed a rapid proliferation,earlier colony confluence and shorter time for the first passage.
[Key words]Marrow; Mesenchymal stem cells; Rabbit; Cell culture
骨髓基质中存在骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),其具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等多向分化潜能,是组织工程学技术的重要的种子细胞[1]。目前,国内外已分离培养出骨髓间充质干细胞(MSC),但尚无统一的分离培养方案。虽然有多种MSCs的分离方法,但密度梯度离心法和贴壁分离法是目前骨髓间充质干细胞最常用的分离培养方法。本实验应用密度梯度离心分离法与贴壁分离法对骨髓间充质干细胞进行分离培养,并比较分析这两种分离法对MSC生物学特性的影响,为选择对MSCs损伤小、易于贴壁生长和操作简单的MSCs分离方法提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料
DMEM/F-12培养基(Gibco,USA),胰蛋白酶(Gibco,USA),EDTA(sigma,USA),胎牛血清(Gibco,USA),其他均为国产分析纯试剂。碘化丙啶、噻唑蓝和二甲基亚砜均为SIGMA产品,Percoll为Pharmacia公司产品。实验动物日本大耳白兔12只,体重2kg左右,雌雄随机,动物饲养条件为25℃,湿度60%~ 70%。
1.2 方法
1.2.1 骨髓细胞的制备 用3%戊巴比妥钠将兔全身麻醉,用脱毛剂脱去兔后下肢的毛发,用3%的碘酊和75%酒精彻底消毒兔后下肢后移入工作台,铺无菌巾,解剖出胫骨上、下端,用骨钻分别在胫骨上端和下端打孔,暴露骨髓腔。用7号针头刺入两侧骨端的骨孔内,用加有肝素的DMEM 培养基反复冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞悬浮液备用。
1.2.2 离心分离法制备MSCs 将骨髓细胞悬浮液贴壁加入到预置等体积1.077g/L的Percoll淋巴细胞分离液的离心管中,2000r/min离心20min。吸取中间乳白色的界面层,与5倍体积的生理盐水混匀后1000r/min离心5min,除去残留的Percoll成分。用磷酸盐缓冲液洗涤1次,然后均采用F12-DMEM 培养液(含体积分数为0.1的进口胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素)重悬细胞,按1×105的密度接种于25mL培养瓶中,37℃、0.05%的CO2饱和湿度下培养,3d后首次更换培养液,弃去未贴壁细胞,此后2~3d换液1次。
1.2.3 贴壁分离法制备MSCs 将骨髓冲洗液放入平皿,再抽出平皿中液体对髓腔进行二、三次冲洗。用吸管反复吹打呈单细胞悬液,每个胫骨的骨髓单细胞悬液经接种入一个25mL培养瓶中,于37℃ 、体积分数为0.05的CO2孵箱饱和湿度培养,5d后首次更换培养液,弃去未贴壁细胞,此后每三四天换液1次。
1.3 细胞计数、细胞形态学观察
在倒置显微镜下,每天观察贴壁分离培养、密度梯度离心培养条件下的原代及传代细胞的生长情况和活体形态特征。MSCs活力测定取1～3代传代细胞,制成单细胞悬液,以0.4% 台盼蓝作为染色剂,用细胞计数板计数活细胞和死细胞,共3次,取3次平均值,计算细胞活力:活细胞率(%)=活细胞数/(总细胞数-着色细胞数)×100。骨髓间充质干细胞按2×104/孔接种于24孔培养板中。分别于接种后第2,3,4,5,6,7天收集4个复孔细胞(注:原代培养细胞于接种后4d换液时开始,即4,5,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15,16),用酚酞蓝拒染法计数活细胞。根据计数结果绘制生长曲线。取MSCs按2×104个细胞/孔接种于24孔培养板内,从接种后第2天起,每日随机收集4个复孔细胞用计数,取均数描记生长曲线。
1.4 MSCs传代培养
原代细胞长满单层后,即可进行传代,首先弃去培养液,用CMF-PBS液洗细胞两次后,加入消化液(0.25%胰蛋白酶+0.01% EDTA)约1mL,消化约5min,倒置显微镜下证实细胞已完全分离(此时镜下可见细胞呈圆球形),加入4mL含血清培养基,反复轻轻吹打成单细胞悬液,离心并用无血清培养基洗涤1次后重新加入含血清培养基计数,按所需密度传代培养或冷藏。
1.5 MSCs细胞的HE、Gimas染色及细胞骨架制备
Gimas及HE染色采用文献报道方法,细胞骨架制备按参考文献[2]方法。
1.6 MSCs流式细胞仪观察制样
按文献[2]的方法制备观察样本,用流式细胞光度计(FCM)检测,采用激发波长为488nm的氩离子激光,DNA被PI着色成红色荧光,蛋白质被FITC着色成绿色荧光,打印出各组细胞周期所占百分比,计算增殖指数(proliferation index,PIX)衡量细胞的增殖活性,PIX=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)×100%。两组检测数据用均数±标准差(χ±s)表示,各项指标差异显著性用t 检验。
2 结果
2.1 细胞形态学观察
2.1.1 密度梯度离心法 细胞培养24h后,均可见大圆形细胞与少量小圆形细胞悬浮于培养液中,4d首次换液后可见少量细胞呈短梭形、多角形细胞及三角形,培养到12~14d细胞增殖铺满至80%左右,15~16d细胞增殖逐渐汇合成单层细胞。传代后至第3代时细胞形态较均匀,呈长梭形集落状分布。
2.1.2 贴壁分离法 细胞培养24h后,均可见数目较多的小圆形细胞、血细胞悬浮于培养液中。4d时首次换液后可见到梭形、多角形细胞及三角形的贴壁细胞;第7~ 8天可见这些细胞呈集落样分布;至第10~12天细胞增殖铺满至80%左右,14~15d时增殖逐渐汇合成单层细胞。Gimas 染色可见细胞核为紫红色,圆形或椭圆形,镜下可见分裂相细胞,两种分离方法未见不同。(图1)
2.2 细胞活性检测
密度梯度离心法:活细胞率为96.2%,贴壁分离法:活细胞率为98.7%,组间比较差异无显著性(P>0.05)。
2.3 细胞生长曲线
见图4,应用密度梯度离心法与贴壁分离法第1代细胞生长曲线测定结果是密度梯度离心法的MSCs生长期比贴壁分离法MSCs的生长曲线延迟1~2d。第2、3代细胞生长曲线测定结果,细胞生长曲线基本相似,在培养1d时,细胞量稍有减少;第2天开始至第6天,细胞呈指数生长,细胞数迅速增长,7d进入平台期,此后细胞数目无显著改变,细胞增殖减慢(图2)。
2.4 培养MSCs细胞骨架观察
镜下可见细胞骨架主要结构形式为环形排列,贯以辐射状微管组成圆形蜘蛛网形,细胞间有角形的突起。随着细胞传代次数的增大,细胞骨架逐渐过渡到以梭形细胞骨架为主要形式(图3)。
2.5 培养MSCs的细胞周期
第3代MSCs培养72h后,经PI和FITC双染在流式细胞仪下观察分析可见细胞增殖活跃,细胞蛋白质含量较丰富。贴壁法MSC:G1期细胞为67.5%,G2期细胞为28.9%,S期细胞为3.6%,细胞增殖指数为(PIX)32.5%,离心法MSC:G1期细胞为68.2%,G2期细胞为28.1%,S期细胞为3.7%,细胞增殖指数为(PIX)31.8%,经统计学分析贴壁法和离心法MSC的PIX差别无意义(表1)。
3 讨论
骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)是具有不断增殖和自我更新能力的成体干细胞之一,在适当的条件下,可分化为成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞[3-7]。获得大量高纯度的MSCs是将MSCs用于研究或临床治疗的基础,目前用于分离MSCs的方法主要有贴壁分离法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。其中后两者由于所需仪器昂贵、对MSCs损伤较大加之骨髓间充质干细胞尚未发现其特有的表面标志,故较少应用[3]。目前常用方法仍为贴壁法和密度梯度离心法。
本实验采用贴壁法分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,随着细胞传代,去除其它可贴壁的杂质细胞,传过三代后细胞形态趋向一致,获得较为纯化的梭形成纤维样细胞(MSCs)。应用密度梯度离心法在原代培养获得的细胞,仍需用贴壁法进一步纯化,并且其操作步骤复杂,离心过程中不可避免地造成细胞损失或损伤,同时发现其原代培养时细胞的活性和生长曲线都迟于贴壁法分离的MSCs,而且MSCs贴壁所需的时间较贴壁分离法长,这可能与离心过程中丢失了骨髓微环境中对骨髓间充质干细胞生长有利的细胞因子和促贴附物质有关。原代培养中可见离心法的MSCs纯度较贴壁法的MSCs大,但随着细胞的传代,两者之间的差别逐渐消失。本实验发现应用离心分离法与贴壁分离法经过传代都可获得活性好、形态均一的骨髓间充质干细胞,但在实验过程中要避免软组织的细胞污染冲洗出的骨髓细胞,对所用试剂尽量做到现用现配。同时应用离心分离法时应注意时间不能过长,离心力不能过大,尽量减少细胞的损伤。本研究揭示虽然密度梯度离心法理论上可在原代获得较纯化的细胞,但仍需用贴壁法进一步纯化,而且容易发生细胞污染和损伤等,因此其并不具有明显优势,相反贴壁分离法具有方法简单、细胞损伤小等优点。
总之,本实验应用的两种方法均可获得可靠的MSCs。对原代培养的MSCs,贴壁分离法具有对MSCs损伤小、易于贴壁生长和操作简单等优点,但其MSCs纯度较离心分离法稍低。经过多次传代后采用两种方法所获得的MSCs的生物学特性已无区别,均可获得具有良好的活性的MSCs。
[参考文献]
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(收稿日期:2009-09-26)
