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[中图分类号]R446.6 [文献标识码]A [文章编号]1006-1959(2009)11-0020-02 人类免疫缺陷病毒(HIV)检测的主要目的是用于获得性免疫缺陷综合症即艾滋病(AIDS)的病原体诊断、检出HIV携带者、HIV指导抗病毒药物的治疗,以阻断HIV的传播途径[1]。HIV血清学诊断仍然是AIDS早期诊断的主要依据[2]。近年来,随着HIV检测技术的进一步发展,P24抗原检测、免疫印迹试验、CD4�+T淋巴细胞检测、核酸病毒载量测定等[3]相继应用于HIV血液筛查、诊断、治疗监测、控制AIDS的流行。目前,基因芯片技术已成为HIV实验室诊断的发展方向。本文就近年来HIV检测的研究进展综述如下。
1 抗原检测
常用的HIV抗原检测是P24抗原技术,P24抗原是HIV的主要结构蛋白,在病毒的包装和成熟过程中起重要作用。P24蛋白的氨基酸序列在HIV各毒株之间高度保守,缺失P24会导致病毒无法正常组装。机体感染HIV后,P24抗原是最早能从血清中检出的病原学标志,通常感染后约2～3周即可检出,1～2月左右进入抗原高峰期,然后随着HIV抗体的产生形成抗原抗体复合物。
2 抗体检测
常用的HIV抗体检测技术包括初筛试验和确证试验,酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、金免疫渗滤实验、快速检测和明胶颗粒凝集试验仅作为筛查试验,免疫印迹试验、条带免疫实验、放射免疫沉淀实验作为确认试验。
2.1 HIV抗体初筛试验
2.1.1 ELISA:适用于大批量标本的检测,目前是大、中、小型医院实验室筛查HIV抗体的主要技术手段。ELISA的基本原理是将待测抗原或抗体先固定于固相载体表面,再用酶标记的抗原或抗体与已被固定的相应抗体或抗原发生特异性反应,加入酶底物及色原后呈色,呈色程度用吸光度(A)值表示,所测A值与待测抗体或抗原的水平呈相关关系,读取结果需要用酶联检测仪。作为检测HIV抗体的最主要方法,其试剂在经过了第1代、第2代、第3代后,已经发展到第4代检测试剂。
2.1.2 免疫荧光法(IFA):IFA是借助抗体反应进行荧光染色的诊断技术,其原理是用H9或HUT78培养细胞作为载体,用HIV感染细胞。该细胞内就会含有HIV抗原,将HIV感染的淋巴细胞涂于玻片上,固定,制备为抗原片,加入待检血清,待检血清中的HIV抗体与抗原结合后,再与荧光素标记的抗人Ig结合,在荧光显微镜下可见到细胞内有黄绿色荧光。该方法的优点是操作简便、敏感性高、特异性比ELISA法高。
但缺点是非特异荧光较难去除,所以只能用于HIV抗体初筛实验,阳性结果还需要确证实验证实。
2.1.3 金免疫渗滤实验(GIFA):GIFA是以酶作标记物和以胶体金为标记物用于快速检测艾滋病毒抗体的渗滤实验。其方法是将胶体金标记技术与快速免疫斑点结合技术相结合,利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用,使抗原抗体反应在固相上迅速完成,然后用胶体金标记的SPA直接显色。这些方法具有快速简单、不用仪器、目测观察结果的优点,在临床检测中广泛应用。目前主要应用硒作为标记物建立了免疫层析实验。
2.1.4 快速检测(RT):HIV抗体快速检测试剂是以胶体金或硒为标记物,硝酸纤维素膜为载体,采用层析形式进行固相免疫测定的技术为原理制备的。该类试剂敏感性较酶联免疫试剂低,其使用范围受到一定限制。但该类试剂比较稳定,可以在室温下保存一年或更长的时间,且操作简单,不需要仪器设备,尤其适用于单份标本的测定。快速检测试剂一般在10～30min内测出结果。
2.1.5 明胶颗粒凝集试验(PA):PA是HIV血清抗体检测的一种快速方法。该方法原理是将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体,与待检标本混匀后在室温下作用,当待检标本含有HIV抗体时,经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原抗体反应,根据明胶颗粒在孔中的凝聚情况判读结果。
2.2 HIV抗体确认试验
2.2.1 WB:免疫印迹或免疫转印技术是在DNA印迹术发展而来的新型免疫生化板术,WB是将HIV病毒蛋白通过SDS-PAGE把分子量大小不等的蛋白带分离开来,再把这些已经分离的不同蛋白转移到硝酸纤维素膜上,再将此膜切割成条状,每一条硝酸纤维素薄膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。血清中若含有抗HIV,就会与膜上的抗原结合,冲洗掉多余的抗体,然后加入抗人IgG酶结合物并温育,洗涤后加入底物,有反应的抗原抗体结合带呈现紫褐色,根据出现条带情况来判断结果。WB是目前最特异、最敏感的证实HIV感染的方法,也是国内HIV确认的首选方法。
2.2.2 条带免疫试验:条带免疫试验的原理及操作方法与WB基本相同,区别在于条膜的来源和组成不同。该实验的优点是检测时抗干扰强,特异性高,克服了WB实验中使用病毒裂解产物可能产生的同相载体上某些重要抗原不足。唯一缺点是合成抗原不能糖基化,它的立体构象与天然抗原有一定差异,在某种程度上影响了HIV抗原检测抗体的能力。
2.2.3 放射免疫沉淀试验(RIPA):本法是将病毒的蛋白与待测血清混合,如有HIV抗体,则同位素标记的HIV蛋白与之结合产生沉淀,沉淀物用配套的缓冲液和十二烷基硫酸(SDS)洗脱,即可将病毒抗原分离,最后病毒蛋白用放射自显影鉴定,同时用已知的分子标记物比较。此方法敏感性和特异性比WB实验方法高,但费时且技术难度大,目前难以普及推广。
3 CD4�+和CD8�+T淋巴细胞计数
人体感染了HIV后,其主要病理过程是免疫系统的损害,主要表现为CD4�+T细胞的丢失,绝对数量的减少,同时CD8�+细胞数量增加,使CD4�+和CD8�+的比例失调。外周血中CD4�+的数量被认为是最重要预言HIV感染状态及何时会转为AIDS指标。CD4�+的数量变化与AIDS患者的死亡率密切相关,CD4�+数量越低,患者存活的时间越短。CD4�+也是药物及各种疗法的有效考核指标。但由于CD4�+和CD8�+不是特异性的,如肿瘤患者、先天性免疫缺陷等均可造成CD4�+数量降低和CD4�+/CD8�+比例失调。另一方面由于人体免疫功能受多种因素影响,健康人CD4�+和CD8�+的数量范围较宽,以及CD4�+、CD8�+本身检测结果有一定误差,使结果判断的准确性受到一定限制。
4 核酸检测
4.1 原位杂交:本法是应用特定的标记探针以分子杂交法直接检测标本中的HIV病毒靶核酸,标记探针有放射性标记、酶标记、化学发光标记等。这些方法阳性率比聚合酶链反应(PCR)稍低,随着核酸扩增技术的出现,原位杂交探针技术也失去了其应用价值。
4.2 定量PCR检测病毒载量:目前常用的HIVRNA定量测定(病毒载量测定)方法有逆转录PCR试验(RTPCR)、核酸序列扩增试验(NASBA)、分枝DNA杂交试验(bDNA)。HIVRNAPCR定量检测,敏感性为95%～98%,假阳性率为2%～9%,特异性取决于病毒载量,在急性HIV感染时敏感性为100%,特异性为97%,当在病毒载量大于105拷贝/毫升时特异性为100%。核酸检测技术主要用于被高度怀疑有原发感染,且经抗体检测之后抗体检测阴性或不确定时;有高危行为史或暴露史,特别是伴有相应的临床表现时,用核酸检测进行辅助诊断。早期诊断主要用于个体检测、血液筛查、性病门诊患者筛查、HIV阳性产妇的婴儿诊断。
4.3 实时荧光定量PCR技术(FQPCR):国内已使用了HIV荧光PCR检测试验。本实验是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。国外使用基于荧光实时PCR技术的核酸检测系统(NAT),同时检测乙型肝炎与丙型肝炎病毒和HIV-1核酸,对于血清学检查阴性的献血员进行筛查,以弥补窗口期造成的漏检[1]。
5 基因芯片技术
HIV病毒的基因芯片将PCR技术与核酸分子杂交完美结合,通过对HIV基因组分析,将该病毒的高度保守序列作为鉴定指标,可以直接对病毒病原体进行检测,极大地提高了诊断的准确性。目前应用DNA芯片技术在艾滋病患者出现抗体反应前检测HIV,对艾滋病的早期诊断有十分重要的意义。基因芯片的发展包括以下几个方面应用:①单链DNA片段芯片的应用,单链DNA片段可以最优化地反映其所代表的基因。②单核苷酸多态性(SNP)芯片的应用,SNP指基因组中微小的基因序列差异,SNP谱不仅可用更精确的个体识别,而且可用于个体疾病易感性的检测。③比较基因组杂交(mCGH)的应用。④基因表达谱检测应用。⑤疾病诊断基因芯片应用。
综上所述,从P24抗原、抗体、T细胞计数、核酸、基因芯片等五个方面综述了HIV实验室检测研究进展和发展趋势,第4代ELISA试剂的研制成功,在缩短“窗口期”,提高检测敏感性方面有良好的应用前景。核酸技术的应用和CD4�+T淋巴细胞的检测用于AIDS患者的疗效观察是标准指标。生物芯片技术作为PCR技术后的下一次革命性技术突破,将会给HIV检测带来一个新的发展方向。
