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【摘要】 目的 了解鲍曼不动杆菌耐药谱及碳青霉烯酶的研究。方法 用VITEK60型全自动药敏分析系统鉴定药敏系统及纸片扩散法进行药敏实验；PCR扩增和测序分析检测碳青霉烯酶VIM、IMP、OXA-23和OXA-24。结果 217株鲍曼不动杆菌中头孢哌酮/舒巴坦耐药率最低，其次是亚胺培南，再者是头孢他啶和哌拉西林/他唑巴坦；头孢哌酮/舒巴坦和头孢他啶的中介率分别是27.6%和19.8%； 20株亚胺培南耐药菌中， PCR 扩增VIM、IMP和OXA-24均阴性；OXA-23基因扩增显示19株（95%）阳性，PCR产物并经序列分析证实为OXA-23。结论 碳青霉烯类抗生素的长期广泛应用使鲍曼不动杆菌的耐药率不断升高；产OXA-23型β-内酰胺酶是本院鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药的重要原因。�
【关键词】 鲍曼不动杆菌；碳青霉烯酶
The resistant characteristic and carbapenemases in acinetobacter baumannii
FENG Hong-jun, NIU Li-lin, LI Hua-ru,et al.The First People’s Hospital of Pingdingshan， Henan 467000，China
【Abstract】 ObjectiveTo investigate the resistant characteristic and carbapenemases in acinetobacter Baumannii（Ab）.Methods Identification and analyses all specimens were identified by VITEK- 60, drug resistances were detected by VITEK- 60 , the drug resistance to SCF were detected by Kirby -Bauer test. PCR and DNA sequencing were performed to determine VIM，IMP，OXA-23 and OXA-24 β-lactamase. Results 217 strains, the resistance rate to sulperazone in 217 strains is the lowest, then to the Imipem’s ;The mid-drug-resistance rate of the sulperazone is 27.6%, and the ceftazidime’s is 19.8%. Of the 20 imipenem resistance strains, VIM、IMP and OXA-24 β-lactamase genotype were all negative, PCR and sequencing found 19 strains（95%）produced OXA-23.Conclusion The resistance rates is increasing to advance as longer-term or broad to use carbopenem; OXA-23 production is the important resistance mechanism in Imipenem.�
【Key words】 Acinetobacter baumannii；Carbapenemases
鲍曼不动杆菌是引起院内感染的重要病原菌,它对多种抗菌药物耐药, 临床上治疗比较困难。亚胺培南对不动杆菌有较好的抗菌活性, 往往是鲍曼不动杆菌院内感染的首选抗菌药物[1]。但随着亚胺培南在临床的广泛应用, 对亚胺培南耐药的不动杆菌也日益增多[2]。为了解亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌在本院的耐药性及流行情况,笔者对在本院收集到的亚胺培南耐菌株进行耐药性分析, 并对碳青霉烯酶基因进行了检测。�
1 材料和方法�
1.1 收集本院2005年12月至2006年12月间住院患者各类标本中分离出多重耐药菌株217株，其中来自痰液的159株，疮口分泌物21株，尿液7株，腹水6株，血液5株，其他标本26株。并取对亚胺培南耐药菌株20株进行碳青霉烯酶基因进行了检测。�
1.2 分离培养 按《全国临床检验操作规程》进行细菌分离培养。�
1.3 质控菌株 大肠埃希菌(ATCC 25922)，铜绿假单胞菌(ATCC 27853)。�
1.4 鉴定和耐药谱的分析 用VITEK60型全自动药敏分析系统鉴定和检测鲍曼不动杆菌的耐药性，用K-B纸片扩散法检测鲍曼不动杆菌对SCF的耐药性。头孢哌酮/舒巴坦折点参考头孢哌酮标准。�
1.5 酶基因PCR检测 各酶基因扩增所用引物序列为：blaIMP-A(CGGCC(G/T) CAGGAG(A/C)G(G/T)CTTT)和 blaIMP-B(AACCAGTTTTGC(C/T)TTAC(C/T)AT); blaVIM-A(AT TCCGGTCGG(A/G)GAGGTCCG)和blaVIM-B(GAGCAAGTCTAGACCGCCCG); blaOXA-23-A(GATGTG TCATAGTATTCGTCG)和blaOXA-23-B(TCACAACAACTAAAAGCACTG); blaOXA-24-A(CAAGAGCTTG CAAGACGGACT和blaOXA-24-B(TCCAAGATTTTCTAGC(A/G)ACTTATA。IMP-、VIM- 、OXA-23-、 OXA-23型金属酶基因PCR反应参数为93℃预变性2 min，然后按93℃1 min→55℃1 min→72℃1 min。共循环35周期。最后一个72℃延长至2 min。产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果。PCR产物纯化后测序。�
2 结果�
2.1 多重耐药菌的耐药性分析 在217株多重耐药鲍曼不动杆菌中，头孢哌酮/舒巴坦耐药率最低（24.4%），其次是亚胺培南（39.1%），再者是头孢他啶（52.1%）和哌拉西林/他唑巴坦（55.7%）。 但头孢哌酮/舒巴坦和头孢他啶的中介率分别是27.6%和19.8%。与文献报道不一致[3]见表1。�
2.2 碳青霉烯酶基因检测显示 20株菌株中，经OXA-23特殊引物经扩增后，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,在19株中出现了1 067 bp的阳性条带（见图1），此PCR 产物经纯化后测序并与GenBank数据库公布的序列进行比较后发现, 所有PCR产物100%与OXA-23 基因同源。未能扩增出VIM、IMP和OXA-24基因。同时扩增了4株亚胺培南敏感株，经1.5%琼脂糖凝胶电泳证实OXA-23均为阴性。
3 讨论�
近年来随着β-内酰胺类抗生素等广谱抗菌药物的广泛使用，诱导了大量鲍曼不动杆菌耐药株的产生，其临床分离率也越来越高，并形成了对单一抗菌药物耐药到多重耐药甚至全耐，由低耐药率到高耐药率的发展和变迁。本研究中显示，鲍曼不动杆菌对第一、二代头孢菌素几乎耐药，对三代头孢菌素除头孢他定稍低外，其他都达60％以上，并且对大多数β-内酰胺类耐药率有上升的趋势。对头孢他啶的耐药率较低，可能由于头孢他啶对β-内酰胺酶有高度稳定性和有效血药浓度持续时间较短的原因。在加入β-内酰胺酶抑制剂舒巴坦、他唑巴坦后，抗菌药物的耐药率下降，成为治疗多重耐药鲍曼不动杆菌的一线药物。哌拉西林和氨苄西林同属青霉素类，哌拉西林本身抗菌活性强于氨苄西林，但氨苄西林/舒巴坦的协同作用优于哌拉西林/他唑巴坦。表明所产生的β－内酰胺酶活性多能被舒巴坦抑制, 但其而较少被克拉维酸和他唑巴坦抑制，舒巴坦对β-内酰胺酶的抑制作用优于他唑巴坦。这可能与他唑巴坦抑酶谱窄有关。�
碳青霉烯酶是指能够明显水解亚胺培南或美罗培南的一类β-内酰胺酶，它包括Ambler分子分类为A、B、D的3类酶。从不动杆菌中分离出的碳青霉烯酶按Ambler分类法主要分为B和D两类。B类酶主要是指金属酶。金属酶需要金属离子如Zn��2+�等的转移表现其催化活性。根据氨基酸的同源性，Bush又把金属酶分成三组结构亚型B1, B2, B3[3]在鲍曼不动杆菌中发现的主要是B1亚型，包括IMP类以及VIM类。目前在不动杆菌属中只发现了四种IMP类金属酶IMP-1, IMP-3和IMP-4, IMP-7[4，5]。其活性不被克拉维酸等抑制剂所抑制,但可被EDTA所抑制。它们具有很强的水解碳青霉烯类抗菌药物的能力，是导致临床治疗失败的又一大原因。2002年韩国Yum等[6]在不动杆菌中又发现了位于整合子中的VIM-2，与IMP酶的同源性[7]。�
本研究中未检出VIM、IMP和OXA-24基因,但有95%的菌株经PCR产物电泳和测序证实产OXA-23型碳青霉烯酶，而OXA-23阴性的1株菌株经多次检测MIC值均为临界值（16 ug/ml）。本组菌对亚胺培南的高耐药率和高MIC值，可能还与其他耐药机制参与有关。有研究发现OXA-24对亚胺培南、米诺配能等碳青霉烯类抗菌药物耐药，分子克隆发现这类细菌染色体上编码碳青霉烯类抗菌药物水解酶，同时伴有22 kd和33 kd的外膜孔蛋白的低表达和抗生素靶位的改变[8]。�
随着抗菌药物的广泛应用，鲍曼不动杆菌的耐药现状日趋严重，加强鲍曼不动杆菌耐药性监测、进一步深入研究细菌的耐药机制,从预防耐药性和控制感染角度出发不断研制和开发新的抗菌药物和非抗生素类抗菌药物,将成为今后的工作重点。�
参 考 文 献�
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［2］ Afzal - Shah M,Livermore DM. Worldwide emergence of carbapenemresistantAcinetobacter spp. Antimicrob Chemother ,1998 ,41( 5) :576.�
［3］ Bush K. Metallo-β-lactamases: A class apart. Clinical Infectious Diseases，1998,27 (1):48-53.�
［4］ Tysall L, Stockdale MW, Chadwick PR, et al. IMP-1 carbapenemase detected in an Acinetobacter clinic isolated from the UK. Antimicrob Chemother， 2002,49(l):217-218.�
［5］ Yu-Wai Chu,Mariya Afzal-Shah, Elizabeth TS,et al. IMP-4, a Novel Metallo-Lactamase from Nosocomial Acinetobacter spp. Collected in Hong Kong between 1994 and 1998. Antimicrob Agents Chemother， 2001,45(3):710-714. �
［6］ Jong Hwa Y, Keonsoo Y, Hyukmin L ,et al. Molecular characterization of metallo β-lactamaseproducing Acinetobacter baumannii and Acinetobacter genomospecies from Korea: identification of two new integrons carrying the bla VIM-2 gene cassetes.Antimicrob Chemother， 2002, 49(5):837-840.�
［7］ Donald HM, Scaife W, Ameyes SGB, et al. Sequence analysis of ARI-1, a novel OXA β-lactamase, responsible for imipenem resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 2000,44(1):196-199.�
［8］ Bouq Cervero Q，Diminguez MQ， et al. Characterization of a nosocomial outbreak caused by a multiresistant Acinetobacter baumannii strain with a carbaprenem- hydrolyzing enzyme high-lever carbapenem resistancem in a baumanniiis not due solely to the presence of β-Lactamases. J Clin Microbiol， 2000,38(9):3299-3305.�
