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[摘要] 目的：探讨总氧自由基清除能力法在葡萄籽提取物抗氧化性评价中的应用。方法：热解2，2"-偶氮双（2-脒基丙烷）产生以碳为中心的氧自由基，与4-甲硫基-2-丁酮酸作用产生乙烯，采用气相色谱法检测乙烯含量。在检测体系中添加不同浓度的葡萄籽提取物，从乙烯产量变化指示被测物清除氧自由基的能力。结果：在0.5～10.0 mg/ml浓度范围内，葡萄籽提取物的总氧自由基清除能力存在浓度-反应关系，相关系数为0.864（n=6）。结论：总氧自由基清除能力法可用于葡萄籽提取物抗氧化性的测定，并提出了拓展该方法的思路。
[关键词] 总氧自由基清除能力；葡萄籽提取物；抗氧化性；药品鉴定
[中图分类号] R286.0[文献标识码] C [文章编号] 1674-4721（2011）06（a）-051-02
Determination of the antioxidant of grape seed extract by total oxyradical scavenging capacity assay
LU Qing1, SHEN Feifei2, YE Huaizhuang3
1.The First Affiliated Hospital of Medicine College of Zhejiang University, Zhejiang Province, Hangzhou 310003, China;2. Health Authority of Zhejiang Province, Hangzhou 310009, China; 3.Public Health College of Zhejiang University, Hangzhou 310058, China
[Abstract] Objective: To investigate the application of total oxyradical scavenging capacity (TOSC) assay for evaluating the antioxidant of grape seed extract (GSE). Methods: Peroxyl radicals were generated by pyrolysis of 2,2"-azo-bis (2-methyl-propionamidine)-dihydrochloride (ABAP) at 35℃. Peroxyl radicals could oxidize the substrate α-keto-γ-methiolbutyric acid (KMBA) to ethylene, which was measured by gas chromatography.In the detection system made by adding different concentrations of GSE, indicating changes in ethylene production measured from TOSC. Results: In the range of 0.5-10.0 mg/ml, TOSC of GSE made a linear of concentration-response relationship, the correlation coefficient was 0.864 (n=6). Conclusion: TOSC Assay can be used for GSE antioxidant determination, and proposed to expand the idea of the method.
[Key words] Total Oxyradical scavenging capacity; Grape seed extract; Antioxidant; Drug ldentification
葡萄属于葡萄科（Vitaceae Lindl.）葡萄属（Vitis L.）的果实，为落叶藤本植物。葡萄果实中除果肉外，种籽占4%～6%、果皮占8%。葡萄籽提取物（Grape Seed Extract，GSE）中富含原花青素（proanthocyanidins），对人体具有抗氧化、清除自由基、改善微循环、调节免疫力、抗突变、抗过敏及抗感染等多种功效[1-2]。
目前已建立了许多抗氧化剂抗氧化性的体外化学检测方法，如FRAP法（ferricion reducing antioxidant power）[3]、TEAC法（trolox equivalent antioxidant capacity）[4]、DPPH法（2,2’-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical scavenging capacity）[5]、ORAC法（oxygen radical absorbance capacity）[6]、TRAP法（total peroxyl radical-trapping antioxidant parameter assay）[7-8]、TOSC法（total oxyradical scavenging capacity）[9]等，其基本原理均为通过体外模拟生成活性氧（包括羟自由基、超氧阴离子自由基、过氧化氢、单线态氧等），然后加入抗氧化剂（自由基清除剂），再用不同的测定方法和指标反映体系的变化过程。
本研究在Winton等建立的总氧自由基清除能力法（TOSC Assay）基础上，采用改进的方法[10-11]检测GSE的抗氧化性。
1 材料和方法
1.1 仪器设备
紫外分光光度计（日本岛津UV-160），气相色谱仪（日本岛津GC-14B），旋转蒸发器（上海申科机械研究所ZFQ-85A），恒温振荡水浴箱（上海科器公司DKZ-2型），硬质顶空瓶（20ml，Agilent），低温离心机（Beckman-Coulter Microfuge-22R），真空干燥箱（上海医用恒温设备厂DZF-4型）等。
1.2 试剂
2,2"-偶氮双（2-脒基丙烷）二盐酸盐[2,2"-azo-bis-（2-methyl-propionamidine）-dihydrochloride，简称ABAP，日本Wakochemical株式会社]。4-甲硫基-2-丁酮酸钠盐（α-keto-γ-methiolbutyric acid，简称KMBA，Sigma公司）。石油醚、乙醇、乙酸乙酯、磷酸钠、三氯醋酸等均为国产分析纯试剂。葡萄籽（产地新疆），葡萄籽提取物对照品（山东省蓬莱市海洋生物化工有限公司提供，原花青素含量≥99%）。
1.3 试样提取
筛选干燥葡萄籽，经石油醚脱脂、干燥、粉碎（20～40目），采用乙醇浸提-乙酸乙酯纯化工艺[12]。浸提条件为60%乙醇、温度50℃、料液比1∶7、提取时间30 min、提取5次；纯化条件为3倍体积乙酸乙酯、pH 值3.5、提取3次。最后真空干燥（-0.08MPa，50℃）24~36 h，得到红棕色粉末状提取物。
参照《中国药典》2010版一部附录ⅨG、ⅦG以及文献[13]分别测定GSE的干燥失重、水中不容物（试液浓度1%、25℃）、pH值（试液浓度1%、溶于水）、原花青素含量（紫外分光光度法，λ280 nm），以确定提取物的质量。
1.4 TOSC测定
本方法已在文献[10]中详述，采用气相色谱法（GC）检测反应产物乙烯，并以TOSC值指示抗氧化剂的抗氧化性以0.1 mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4），配制0.2 mol/L ABAP和0.25 mmol/L KMBA（均为用前临配，4℃避光贮存）；在20 ml顶空瓶内分别按样品管（KMBA 0.8 ml+样液0.1 ml）、对照管（KMBA 0.8 ml+PBS 0.1 ml）加入相应试剂，密封后用1.0 ml注射器注入0.1 ml ABAP，使溶液终体积为1 ml；置35℃恒温水浴振荡60 min，立即注入30%三氯醋酸溶液0.3 ml终止反应，再用1 ml气密性进样器抽取顶空气体200 μl用于GC分析。
GC检测条件：SPB-1毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），进样器、柱温箱、检测器的温度分别为150℃、60℃、200℃，火焰离子化检测器（FID），载气（N2）流速1 ml/min，分流比20∶1。
精确称取一定量GSE干燥粉末，用0.1 mmol/L PBS溶解并调整pH值至7.4，每份试样6个平行，按照上述方法进行测定，同时做空白对照。TOSC测定结果以x±sD表示，并观察试样TOSC值的浓度-反应关系。
2 结果
2.1 GSE的理化指标
葡萄籽提取物（GSE）的干燥失重3.47%，水不溶物占20.3%，pH值为4.13，原花青素含量为81.1%，GSE得率为12.8%。
2.2 TOSC测定结果
测定了0.5～100.0 mg/ml浓度范围内GSE试样的TOSC值（表1）。结果显示GSE的TOSC与其浓度呈正相关；在一定浓度范围内（0.5～10.0 mg/ml）有较好的线性关系，相关系数为0.864（n=6）。
3 讨论
目前葡萄籽提取物作为天然抗氧化剂（自由基清除剂），已在保健食品、心血管药物、化妆品等领域得到应用。天然植物提取物的抗氧化性评价方法是相关研究的重要内容。本研究初步考察了TOSC法评价GSE抗氧化性的适用性，其特性在于采用GC法检测乙烯，具备灵敏、快速等优点；通过检测体系对照管的控制，减少分析条件波动的影响。检测体系中的KMBA也能接受在其他自由基的攻击而产生乙烯（如Fenton反应产生羟自由基、热解3-morpholinosydnomine产生过氧亚硝基自由基等）[14]，可以此拓展TOSC法的应用范围。
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（收稿日期：2011-03-18）
注：“本文中所涉及到的图表、公式、注解等请以PDF格式阅读”
