【www.zhangdahai.com--其他范文】
摘 要：目的：探讨灯盏花素注射液对实验性视网膜缺血再灌注损伤(retinal isehemia－reperfusion，RIR)后的视神经保护作用及其可能的作用机理。方法：实验分组及给药：将健康新西兰兔54只随机分为正常对照组(18只)，生理盐水对照组(18只)，灯盏花素注射液组(18只)，采用前房穿刺加压灌注使生理盐水对照组和灯盏花素注射液组眼内压升高至14.6kpa(110mmHg)，维持60min，制作兔实验性视网膜缺血再灌注损伤(RIR)模型。造模后立即每日1次按体重分别以耳缘静脉注入灯盏花素注射液，生理盐水对照组同一时间以耳缘静脉给予等量生理盐水，正常对照组不予给药。分别于再灌注1d，3d，7d分别处死每组动物的6只兔子，光学显微镜下和电镜下观察第3d的组织学变化和超微结构，观察各组视网膜电图(ERG)b波振幅，免疫组织化学法测定各组视神经一氧化氮合酶(iNOS)的表达。结果：再灌注1d开始生理盐水对照组ERG的b波振幅缓慢升高，病理组织损害逐渐加重，视网膜中iNOS阳性表达增多，第3天达高峰，第7d开始下降，与正常对照组相比有显著差异(P＜0.01)。与生理盐水对照组相比，灯盏花素治疗组电镜下病理组织损害减轻，ERG的b波振幅明显恢复(P＜0.01)，iNOS阳性神经元明显减少(P＜0.01)，第7d时灯盏花素治疗组与正常对照组的ERG的b波和iNOS阳性神经元差异无显著意义(P＞0.05)。结论：灯盏花素注射液可以减轻视网膜缺血再灌注损伤对组织造成的损害，其机理是灯盏花素注射液可以减少细胞内Ca2+超载，清除自由基和增强抗氧化能力，从而对实验性视网膜缺血再灌注损伤有一定的保护作用。
关键词：灯盏花素；视网膜缺血再灌注；iNOS
中图分类号：R285．5 文献标识码：A
文章编号：1007-2349(2008)01-0030-04
视网膜缺血再灌注(Retinal isoeheimal reperfusion，RIR)损伤是眼科常见的一种病理过程。见于青光眼、视网膜中央动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、缺血性视神经病变、糖尿病视网膜病变等多种眼病，造成视网膜神经组织的损伤，严重损害视功能。因此，探讨视网膜缺血再灌注损伤机制，寻找新的有效而又没有明显副作用的药物来防治视网膜缺血再灌注损伤，已成为全世界眼科专家及众多学者的研究课题。
虽然氧自由基在视网膜缺血再灌注损伤发挥的重要已明确，但大部分抗氧自由基药物仍处于临床前期。灯盏花素又名灯盏细辛，自20世纪70年代开始应用于临床多种疾病的治疗，安全可靠，并具有抗氧自由基、保护视神经及视网膜的功能。本实验旨在通过建立兔视网膜缺血再灌注的动物模型，观察不同剂量灯盏花素注射液对损伤的视网膜在自由基代谢方面的影响，为临床寻找安全、有效治疗视网膜缺血再灌注损伤的药物提供理论依据。
1 材料和方法
1．1 动物及分组 健康新西兰兔54只，由昆明医学院动物中心提供，体重2.0～2.5kg，雌雄不限，随机分组后编号，分笼喂养，试验前裂隙灯显微镜及眼底镜检查双眼角膜透明，瞳孔等大等圆，虹膜血管清晰，眼底无异常无异常。54只随机分为正常组，灯盏花素注射液组和生理盐水对照组各18只。每组再随机地分为再灌注后1、3、7d组，每组6只新西兰兔，每组右眼为实验组眼，左眼不予处理。
1．2 主要药物、仪器与设备 灯盏花素注射液(云南龙津药业有限公司)，直接检眼镜(苏州医疗器械厂)，光学显微镜(日本Olympus公司)，多聚赖氨酸，兔抗大鼠NOS-2多克隆抗体及即用性sp免疫组化试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司)，DAB显色试剂(福建新迈公司)，H-600电子显微镜(日本日立公司)，视网膜电生理仪(意大利安倍公司)。
1．3 动物模型的建立 正常对照组不造模。生理盐水对照组和灯盏花素注射液治疗组均制造兔视网膜缺血损伤的模型，具体方法是新西兰兔经耳缘静脉注入3％戊巴比妥钠(100mg／kg)全麻后，眼局部滴用爱尔卡因眼液，1％安尔碘消毒兔眼周皮肤，氯毒素眼液消毒眼球，复方托品酰胺散瞳，将连接无菌生理盐水输液管的7号小儿头皮针沿颞侧角巩膜缘刺入前房，避免损伤虹膜及晶体，缓慢升高输液瓶与实验眼垂直距离150cm处，此高度在眼内形成110mmHg(14.46ka)的眼压。眼内压升高后，可见球结膜2min内苍白，由于眼底血管被阻断，导致眼底反光由红色变为白色，同时虹膜也因缺血而变白，直接检眼镜观察眼底，可见到眼底血管变细或呈念珠状，维持60min缓慢降低盐水瓶至动物水平，拨出针头，可见眼结膜充血，视网膜血液重新再灌注。即视网膜缺血再灌注损伤的模型建立成功。如果在穿刺中不慎损伤晶状体，则去掉该动物的数据，术后涂抗生素眼膏以防止角膜感染。
1．4 给药方法 在视网膜缺血再灌注损伤药物治疗组按每kg体重2mg灯盏花素注射液经生理盐水稀释后从耳缘静脉给药，生理盐水对照组和正常对照组给等剂量生理盐水，在1、3、7d处死各组兔子，每小组6只。
2 观察指标和测定方法
2．1 电子显微镜标本的制作和观察 再灌注3d，沿耳缘静脉注射空气40ml栓塞处死兔子，迅速摘除眼球，在冰环境中环角巩膜缘切开，弃去眼前节和晶状体，外翻眼球，解剖显微镜下剥离视网膜、冰生理盐水冲洗，浸入冷电镜固定液(10％多聚甲醛100ml，25％戊二醛50ml，0.2MPB 250ml，蒸馏水100ml，调节PH至7.4，48h，1％饿酸后固定，脱水、丙酮包埋，同上述部位制成50nm超薄切片，透射电子显微镜观察拍照。
2．2 视网膜电图(ERG)的测定 新西兰兔暗适应30min，新西兰兔经耳缘静脉注入3％戊巴比妥钠(100mg／kg)全麻后，眼局部滴用爱尔卡因眼液。0.5％复方脱毗卡胺散瞳，记录电极即角膜接触镜电极置于角膜接触镜上，电极尽量与角膜最大面积接触，参考电极置于两眼连线中点皮下。操作时间白光闪耀，反应持续时间200ms，光强度10cd・s／m2，每个时间点至少测量3次，间歇期点生理盐水，防止发生暴露性角膜炎，记录b波振幅与处理前b波振幅比值。
2．3 iNOS免疫组化染色 石蜡切片在55～60℃的温度下烤2h。浸入7.5ml／L的H2O2液中20min，以阻断内源性过氧化氢酶物酶。行正常山羊血清封闭以清除非特异性染色。滴加iNOS特异性抗体，测量方法和步骤按说明书进行，阳性结果以胞浆及胞盒内出现棕黄色和黄色颗粒为准。每只眼球取两张切片，用医学图象分析统计进行iNOS的吸光度。
2．4 统计学分析 实验结果输入计算机，运用统计软件(SPSS 11.0)进行统计分析，计算组间差异采用单因素方差分 析，组间两两比较采用LSD检验。
3 结果
3．1 高眼压后大鼠外眼变化情况 所有模型眼均有球结膜水肿、充血、角膜水肿、雾状混浊。球结膜水肿、充血在2～4d后消失，角膜水肿均于次日消失。
3．2 ERGb波的测定 视网膜缺血再灌注损伤后随着时间的延长，兔b波波幅持续缓慢升高。经灯盏花素注射液治疗后，兔b波波幅在各段时间点与生理盐水对照组相比都有明显提高(P＜0.01)，与正常组相比，第7天时，b波波幅在各段时间点无明显差异(P＞0.05)，见表1。
3．3 投射电镜观察 再灌注3d正常组的视网膜神经节细胞和内外核细胞层细胞胞核大，核仁清楚，核膜光滑，胞浆中可见线粒体等细胞器，而生理盐水对照组，视网膜神经节细胞肿胀、退行性变。细胞膜部分溶解、核固缩，偏位，染色质分布不均。细胞质内多数细胞器溶解，形成空白区。仅见的少量细胞器中，线粒体高度肿胀，空泡化、嵴大部分消失，外膜破裂。粗面内质网脱颗粒，滑面内质网扩张。灯盏花素注射液治疗组视网膜神经节细胞轻度肿胀，细胞核完整，核内染色质分布均匀。细胞质内细胞器明显较模型组增加，线粒体轻度肿胀。嵴可见。滑面内质网、高尔基复合体稍肿胀，见图1～3。
3．4 iNOS的免疫组化 正常视网膜内核层和节细胞层有少量iNOS表达。再灌注1d。生理盐水对照组iNOS的表达开始增高，3d时达高峰，7d后渐下降，与正常组相比，差异有显著性意义(P＜0.01)。在各灌注时间点，灯盏花素治疗组iNOS的吸光度与对照组相比明显升高(P＜0.01)，与正常组相比无明显差异(P＞0.05)，见表2。
4 讨论
视网膜缺血再灌注损伤的机制非常复杂，目前认为细胞内Ca2+超载、兴奋性氨基酸的神经毒性，自由基的损伤、细胞因子的作用等多种因素参与了视网膜缺血再灌注损伤的过程。其中自由基的连锁反应和细胞内CaZ+超载是造成组织损伤的中心环节。NO具有自由基的作用，结构简单，极不稳定，由一氧化氮和酶(NOS)催化L～精氨酸生成，对视网膜造成损伤。NO半衰期只有数秒钟，因此，目前多用一氧化氮和酶(NOS)的表达来代表NO的水平。
NO是半衰期很短的自由基气体，正常眼内有少量NO存在，一方面作为神经调质可以抵抗内皮素的缩血管作用，另一方面很多研究表明NO在视网膜缺血再灌注损伤和NMD介导的神经毒性中发挥着重要作用，NO能与超氧阴离子作用生成强氧化物，对组织有很强的氧化作用。引起能量缺乏，DNA损伤，合成抑制以及诱发程序性细胞死亡，破坏视网膜屏障。NO由一氧化氮和酶(NOS)催化L－精氨酸生成，一氧化氮和酶(NOS)分为3种类型，神经元型(nNOS，NOS-1)，主要存在神经细胞内，内皮型(eNOS，NOS-3)，主要存在血管内皮，诱导型(iNOS，NOS-2)，主要存在星型细胞和胶质细胞内。生理性一氧化氮和酶由nNOS和eNOS合成，又称为结构型一氧化氮和酶，其活性依赖于钙。在视网膜缺血再灌注损伤中，nNOS和iNOS及其所产生的NO在视网膜缺血再灌注损伤中起损伤作用。NO通过与超氧阴离子反应产生过氧化氮来促进氧化损伤。NO会引起能量缺乏，DNA损伤，合成抑制以及诱发程序性细胞死亡，破坏视网膜屏障。实验证明，缺血前先眼内注射NOS抑制剂L-NAME可以改善视网膜缺血损伤。本实验中发现视网膜缺血再灌注时导致了视网膜结构和功能的破坏，并伴随着iNOS的升高，在对照组中，第1d iNOS开始升高，第3d iNOS达高峰，7d有所下降。说明iNOS参与了视网膜缺血损伤的过程。与生理盐水对照组和正常对照组相比，灯盏花素注射液能减轻视网膜组织内iNOS的生成，进一步保护了视网膜的结构和功能。
本实验不仅观察了视网膜缺血再灌注损伤时灯盏花素注射液能减少iNOS的生成，兔视网膜缺血再灌注损伤的保护作用，还从行态学上证实了灯盏花素能明显减轻缺血再灌注后视网膜的中期内层水肿，对视网膜缺血再灌注损伤有较好的保护作用。在实验中各个再灌注时间点，灯盏花素治疗组的ERGb波振幅显著高于生理盐水对照组，说明灯盏花素注射液对视网膜缺血一再灌注损伤具有较好保护作用，且随着时间的延长，保护作用增强。
近年来灯盏花素已经被广泛运用于临床来治疗血管性疾病，许多研究证明灯盏花素具有视神经保护作用。灯盏花素可以改善视网膜、视神经微循环，及提高大鼠高眼压状态下造成的视网膜神经节细胞细胞色素氧化酶活性。贾莉君等发现灯盏细辛具有提高和改善急性高眼压后大鼠视网膜神经节细胞的活性及活性节细胞密度的作用。有实验证明灯盏细辛其具有抗氧化，清除自由基等功能，可通过抑制NO途径对H2O2诱导的神经损伤起到保护作用。近年来灯盏花素注射液被大量用于治疗视网膜中央静脉阻塞和缺血性视神经病变等缺血性视网膜疾病，而且已被证实有确切的治疗效果。笔者的实验结果也证实了倍他洛尔保护缺血一再灌注损伤后的视网膜。
灯盏花素，又叫灯盏细辛，是以灯盏花乙素为主含少量灯盏花甲素的黄酮类混合物，是从菊科飞蓬属植物短亭飞蓬[E-rigeron briviscapine(Vant)HanolMass]全草(俗称灯盏花)中经提取、分离、精制而来。灯盏花制剂自20世纪70年代开始应用于临床，目前已有片剂、胶囊、注射剂等多种剂型，己广泛运用于临床治疗多种疾病，具有抗血栓和改善血液流变学等作用。在中医学上具有活血化瘀，通经活络的功效。
灯盏花素对视网膜缺血再灌注损伤的保护机制与其结构密切相关，灯盏花素是黄酮类化合物，清除活性氧的活性基团是酚羟基，酚羟基提供氢原子，与活性氧发生还原反应而发挥作用，灯盏花素本身具有的邻二酚羟基结构能稳定其与活性氧反应所形成的自由基[Hong Liu]。灯盏花素能以电压依赖的方式阻断细胞膜上的Ca2+通道，减少Ca2+内流，降低细胞内钙离子浓度。并直接刺激细胞内ATP依赖性钙泵，使紊乱的细胞内外钙交换趋于正常，减轻钙超载，从而打断了钙离子、氧自由基、兴奋性氨基酸毒性之间的恶性循环，减轻了细胞变性和死亡。灯盏花素能阻止血管平滑肌细胞上L-型钙通道，缓解缺血后视网膜血管痉挛，改善视网膜和视乳头局部血液的供应，保护了内层视网膜组织。
通过实验证实，灯盏花素对视网膜确血再灌注损伤有保护作用，且呈明显的量效关系，灯盏花素在视网膜缺血再灌注损伤中可能不仅是通过抗氧自由基及抑制细胞内钙内流而发挥作用，其作用机制有待进一步研究。通过对灯盏花素对视网膜缺血再灌注损伤保护机制的研究，不仅能为灯盏花素应用于眼科提供事实及理论依据，也为进一步探讨视网膜缺血再灌注损伤的机制及灯盏花素作用机制提供了一条新途径。
