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李春海，陈晓英，王红梅，杨刘玥玲，赵旺生*
（1.西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳 621010；
2.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏拉萨 850009）
从1961 年Clausen 等在脑脊液中发现胱蛋白开始，人们就对（Cystatin）基因家族开始了深入研究。CST3 是一种相对低分子质量的非糖基化碱性蛋白质，是广泛存在于动植物中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，在有核细胞中均有所表达，其参与细胞内外蛋白水解的调控，保护细胞免受不适当的内源性或外源性蛋白酶水解。Frygelius 等发现编码一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，基因的整体结构与人类和其他II 型的编码基因非常相似，有2 个内含子位于与人类相同的位置，在启动子区发现了一个六核苷酸TGTTCT，它是雄激素应答元件（ARE）的核心序列，该区域还包含一个21 核苷酸序列。CST3 蛋白在功能上与免疫应答和精子成熟有关。在免疫方面，CST3 蛋白的缺少可以导致乳胶脂多糖诱导的脓毒症和NLRP3 炎性小体的激活。在精子发生和成熟方面，基因主要从精原干细胞向早期精母细胞表达，并通过调节自噬在小鼠精原干细胞体外维持和移植后减数分裂进程中发挥关键作用。精原干细胞中的抑制会损害精子细胞或精子的产生，CST3 也是晚期生殖细胞发育的重要调节因子。基因作用机理是通过修饰精子表面蛋白和周围液体中的可溶性蛋白来促进精子成熟。研究表明，显著表达于男性生殖道，精浆中CST3 蛋白水平较高，约为血清的37 倍。本研究通过对基因的克隆和对其序列进行生物信息学分析，并利用qPCR 技术对基因在牦牛附睾各区段的表达情况进行研究，以期为牦牛提高繁殖力提供基础数据。
1.1 实验动物 取3 头24 月龄、体格相似、身体健康的公牦牛睾丸组织，牦牛来自于四川省阿坝州红原县屠宰场。使用Hanks 溶液将睾丸组织清洗3 次，并将附睾从睾丸中分离出来，去除结缔和脂肪组织，将附睾分为附睾头、附睾体和附睾尾3 个部分。
1.2 主要试剂 Hanks 溶液，购自福州飞净生物科技有限公司；
Trizol 试剂，购自广州济恒医药科技有限公司；
Taq DNA 聚合酶，购自大连宝生物工程有限公司；
2X SG Fast qPCR Master Mix 试剂，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；
PCR-grade water 试剂，购自上海远慕生物科技有限公司；
双蒸水、0.8%的琼脂糖凝胶，购自香港Gene Company Ltd。
1.3 主要仪器 电泳仪，购自南京普阳科学仪器研究所；
SpectraMax Quick Drop 超微量分光光度计，购自济南来宝医疗器械有限公司；
高速离心机，购自阿法拉伐（上海）技术有限公司；
生化培养箱，购自宁波江南仪器厂；
超净工作台，购自济南童鑫生物科技有限公司；
微量移液器，购自济南欧莱博生物科技有限公司。
1.4 牦牛附睾组织总RNA 的提取 根据Trizol 试剂说明书，提取牦牛附睾头、体、尾部的总RNA，利用0.8% 的琼脂糖凝胶电泳仪检测RNA 的完整性，利用SpectraMax Quick Drop 超微量分光光度计检测RNA 的质量，并保存在超低温冰箱（-80℃）里。
1.5 克隆及设计引物 利用引物设计软件Primer 5.0 设计牦牛基因的PCR 克隆引物，引物序列（5"→3"）为：CF1：GACCATGGTGGGCTCCCC；
CR1：TGGC CTGCCTGTTAATCC。以牦牛附睾组织逆转录所得的cDNA 为模板进行PCR 扩增，采用20.0 μL 扩增体系：DNA 聚合酶10.0 μL，双蒸水7.0 μL，混匀的上下游特异性引物2.0 μL（10 μmol/L），附睾组织的cDNA 加1.0 μL（10 μmol/L）。反应条件：预变性94℃4 min；
94 ℃30 s；
60 ℃30 s，72 ℃2 min，循 环32 次，72 ℃延伸2 min。将产物电泳检测后进行DNA 的纯化并在超净工作台上与目的片段和载体连接、转化及鉴定后，送成都擎科梓熙生物公司进行测序。
1.6 CST3 蛋白质生物信息学分析 利用在线软件EXPASY（https://web.expasy.org/protparam/）分析CST3蛋白质理化性质；
利用线上软件SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）对CST3 蛋白的信号肽进行预测；
利用线上软件SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html#opennewwindow）对蛋白质二级结构进行分析；
利用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在线软件分析、检测CST3 蛋白的跨膜区数量；
利用Softberry（http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcompan&group=programs&subgroup=proloc）在线软件分析CST3 蛋白的亚细胞定位。
1.7 荧光定量PCR 利用Primer Premier 5.0 软件对已克隆得到的基因序列及内参基因UXT（NM_174 029.1）序列进行特异性引物设计，引物序列（5"→3"）分别为：基因 CF2：CGCAAGCAGGTCGTGTCA；
CR2：GGCTGGTTATGGAAGGGA；
UXT 基 因UF：TGTGGCCCTTGGATATGGTT；
UR：GGTTGTCGCTG AGCTCTGTG。荧光定量操作方法按照2X SG Fast qPCR Master Mix 试剂盒说明操作。反应体系共10.0 μL：2X SG Fast qPCR Master Mix 5.0 μL，上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），PCR-grade water 3.2 μL，模板DNA为1 μL（10 μmol/L），以每个样品3 个重复作为对照。反应条件：预变性95℃3 min；
95℃2 s；
60℃25 s；
40 个循环。利用qPCR 技术，以内参基因作为对照基因，以附睾头作为对照组（CY1、CY2、CY3），附睾体（CY4、CY5、CY6）和附睾尾部（CY7、CY8、CY9）作为处理组，运用2方法可计算出基因在附睾组织头、体、尾的相对表达量。
2.1 牦牛基因的测序及分析 通过EXPASY 的分析能够得出，牦牛基因的开放读码框长度为447 bp，含起始密码子ATG 和终止密码子TAA（图1）。NCBI 网站BLAST 同源性比对发现，牦牛核苷酸序列与印度水牛（登录号：KU936088.1）、山羊（登录号：XP_013824066.2）和骆驼（登录号XP_032317598.1）、犀 牛（XP_017703337.1）相 应序列的同源性分别为97.97%、87.16%、68.03%、67.20%。
图1 牦牛CST3 基因的碱基和氨基酸序列
2.2 牦牛CST3 翻译蛋白的理化分析 通过EXPASY在线分析CST3 蛋白的氨基酸理化性质，其中含量最高的为异亮氨酸Leu（12.2%），其次为缬氨酸Val（11.5%）、丙氨酸Ala（10.1%），含量最少的为色氨酸Trp（0.7%）。CST3 蛋白的分子量为16.26 ku，其等电点为9.23，为弱碱性蛋白。采用线上软件对CST3 蛋白的信号肽作预测，结果显示牦牛CST3 蛋白存在信号肽序列，信号肽剪切位点位于第19 号和第20 号氨基酸之间。利用protscale 对CST3 蛋白质进行亲疏水性分析，结果显示最大值3.256，在第19 个位点上；
最小值-2.644，在第120 个位点上，整体为亲水性蛋白（图2）。
图2 牦牛CST3 基因翻译蛋白亲疏水性预测
2.3 牦牛CST3 蛋白的二级结构分析与测定 对CST3蛋白的二级结构分析，发现CST3 蛋白的长度为148 个氨基酸，CST3 蛋白在螺旋区有57 个氨基酸，占比为38.51%；
在延伸链结构处有21 个氨基酸，占比为14.19%；
在转角区有2 个氨基酸，占比为1.35%；
在不规则卷曲状态下有68 个氨基酸，占比为45.95%。
2.4 牦牛基因的跨膜结构分析和预测 对基因的跨膜结构区（图3）分析，结果显示CST3 蛋白在7～29 位氨基酸处存在跨膜结构。牦牛CST3 蛋白质亚细胞定位预测显示CST3 蛋白亚细胞定位于细胞外（图4）。
图3 牦牛CST3 蛋白的跨膜分析
图4 牦牛CST3 蛋白的亚细胞定位
2.5 牦牛基因在附睾不同区域的表达 通过实时荧光定量PCR（qPCR）技术检测基因在牦牛附睾不同区段的表达情况，发现基因在附睾组织的头部、体部、尾部3 个区段中均有表达，存在显著差异，其中在附睾头部表达量最高，附睾体部和尾部表达量相对较低（图5）。
图5 牦牛CST3 基因在附睾不同区域的表达
基因是编码胱抑制素相关的附睾生精蛋白基因，它的缺乏会导致雄性小鼠在体外显示出生育缺陷。本研究分析结果显示，CST3 蛋白序列长度为148，CST3 蛋白在螺旋区有57 个氨基酸，占比为38.51%；
在延伸链结构处也有21 个氨基酸，占比为14.19%；
在转角区有2 个氨基酸，占比为1.35%。CST3 蛋白的氨基末端是对含半胱氨酸的蛋白质起抑制作用的位点之一，CST3 蛋白氨基末端通过结合-淀粉样前体蛋白，竞争性抑制-淀粉样蛋白的产生。此外，CST3 的氨基端残基以及Q88 和C97 可以通过与硫酸乙酰肝素结合来抑制木瓜蛋白酶的活性，在酸性pH条件硫酸乙酰肝素能够降低CST3 蛋白的抑制能力。基因在附睾中主要控制功能性淀粉样结构的形成，且在附睾头部中的表达量高于附睾尾部，这与本研究结果相一致。在人和小鼠上的研究表明，CST3 蛋白68 号氨基酸突变，会产生L68Q 突变体，使得CST3 蛋白在睾丸中异常积累，对生育产生不良影响，含有L68Q 型杂合体的小鼠不育。通过对L68Q 杂合体小鼠的研究发现，L68Q 杂合体小鼠的精子没有明显的结构缺陷，但这种小鼠的精子周围附睾腔液中的成分可能会与精子表面结合，导致精子凝集和细胞膜破坏，最终影响精子的活力和生育能力。在人体中L68Q 胱抑制素C 淀粉样蛋白的存在会改变附睾腔内环境，从而导致精子不能具有受精功能。
在小鼠上的研究发现，在小鼠精原干细胞中CST3 蛋白的抑制会损害精子细胞或精子的物质产生，基因在精原干细胞到早期精母细胞的分化整个时期均有表达，并通过调节自噬在小鼠精原干细胞体外维持和小鼠精原干细胞移植后减数分裂过程中发挥关键作用。核心多能性因子（Oct4、Id1）和关键RNA 结合蛋白（Nanos3）可以传递来自CST3 蛋白介导的自噬的信号。在基因表达敲低的小鼠精原干细胞中观察到细胞增殖抑制和G1 期细胞周期停滞现象，因此，CST3蛋白也是晚期生殖细胞发育的重要调节因子。在正常男性体内，CST3 蛋白在睾丸、附睾、输精管、精囊和前列腺等组织中广泛分布，基因在精囊和前列腺中高度表达，说明男性生殖器官和精浆中CST3 蛋白的主要含量是由这2 种组织的细胞产生的，CST3 蛋白也是男性生殖系统正常和病理性蛋白水解的重要调节因子。在糖尿病患者精液中，CST3 蛋白的丰富度降低，导致精子的活力降低。CST3 蛋白作为一种孕酮依赖蛋白可以与精子结合，增强精子活性，但也抑制胆固醇的流出和精子酪氨酸磷酸化，降低精子获能。在人上的研究发现，男性生殖器官和精浆中存在的CST3 蛋白主要是由精囊和前列腺小体细胞产生的。
基因除了在精子的发生和成熟过程中起重要作用外，还与一些癌症发生、血管和脑部疾病有重要关系。在癌症中的研究发现，CST3 蛋白作为组织蛋白酶B 的抑制剂，被证明是一种促进凋亡和生长抑制因子，并已应用于某些癌症的诊断和预后。此外，CST3 蛋白可以拮抗多种参与促进细胞侵袭/迁移的关键因素，如转化生长因子-（TGF-）和基质金属蛋白酶（MMPs）。因此，CST3 蛋白在一些癌症侵袭和迁移中起负面作用。研究发现，CST3 蛋白促进食管癌细胞的生长并抑制了细胞凋亡。在脑动脉和外周动脉中，CST3 蛋白缺乏可诱发动脉瘤变化。这种变化主要是由于蛋白酶（如组织蛋白酶）的活性不受控制。因此，可以看到结缔组织和血管细胞的广泛变化。此外，CST3 蛋白和组织蛋白酶B 的平衡对于血管重塑至关重要，并且发现改变CST3 水平的基因多态性与脑小血管病等病理学相关。在动脉粥样硬化中，巨噬细胞中CST3 蛋白的缺失会导致巨噬细胞出现自噬功能障碍，并随后导致它们的凋亡，CST3 蛋白在抗原呈递细胞的功能上具有性别依赖性，这种性别依赖性调节在CD11b+细胞中比在CD11c+细胞中更为突出。CST3蛋白在C57BL/6J 小鼠的实验性自身免疫性脑脊髓炎发育中也具有性别依赖性作用。相关研究表明，在女性中，CST3 驱动抗原呈递细胞的激活和抗原呈递能力，从而促进CD4+IFN-的产生和中枢神经系统自身免疫。
综上所述，基因的表达情况与精子的获能和成熟有关，附睾头部主要通过分泌各种物质对精子成熟起重要作用，而基因在附睾头部的高表达证实了本研究结果，但其对精子成熟和获能的作用机制还需要继续深入研究。
本研究成功克隆得到了牦牛基因的CDS 区序列，并对基因序列进行生物信息学分析。通过对CST3 蛋白理化性质分析发现CST3 蛋白为亲水性蛋白，存在跨膜结构域和信号肽。经过qPCR 检测发现基因在牦牛附睾组织不同区段中分布不均，在附睾头部的表达量最高。本研究通过对基因在牦牛附睾组织不同区域的表达情况进行分析，为牦牛附睾精子成熟的机制提供基础材料，同时为牦牛的育种和繁殖提供研究方向。
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