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高也凡，宋哈楠，王育南，吴 月，牛锐利，宗宪春，关伟军
(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；
2.佳木斯大学，佳木斯 154007；
3.牡丹江师范学院生命科学与技术学院，牡丹江 157011)
角膜缘干细胞(LSCs)在未分化的状态下具有无限自我更新的特性[1]。Dua等[2]研究发现，LSCs具有较长的存活时间并表现出高度的自我更新和增殖能力。但由于种属差异、动物年龄及培养基和生长微环境不同，LSCs增殖潜能和维持干燥度也有所不同。对于分离的LSCs多选择DMEM/F12培养基，其中的钙离子有利于干细胞的贴壁生长[3]。此外，研究发现胎牛血清(FBS)能促进干细胞的生长，抑制角膜上皮细胞的增殖；
10-9～10-7mmol/L视黄酸(RA)能促进LSCs的克隆形成率，表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)、霍乱毒素等多种生长因子能调节干细胞的生长与分化[4]。对于不同物种来源的LSCs，所使用的分离方法和培养体系也有所不同。殷吉庆[5]以分散酶联合胰酶法获得山羊角膜缘干细胞(GLSCs)，使用添加20%条件培养基、10% FBS、20 ng/mL EGF及谷氨酰胺、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤和三碘甲腺原氨酸的DMEM/F12培养液培养GLSCs。冯雪倩[6]研究发现，2～6月龄猫角膜缘上、下象限是体外分离猫LSCs最佳取样点；
使用混合酶消化法联合组织块贴壁法分离猫LSCs效果最好，使用含20 ng/mL EGF、10 μg/mL胰岛素及10% FBS的DMEM/F12完全培养基培养猫LSCs，细胞可保持高活性、高增殖率。顾国贞等[7]通过胰蛋白酶消化法分离得到兔LSCs，用含15% FBS的DMEM/F12完全培养液进行体外培养。
迄今为止，已经报道了许多LSCs标志物，阳性标志物有细胞周期调控蛋白ΔNp63a、ATP结合盒转运蛋白(ABCG2)和整合素α9，而阴性标志物有巢蛋白、E-钙黏蛋白、连接蛋白43、外皮蛋白分化相关的蛋白(细胞角蛋白3(CK3)、CK12等)[8-9]。郭志侯[10]首次揭示了小鼠LSCs标志物表达的时间光谱，证明其标志物表达所特有的时间性。LSCs在不同诱导条件下可分化为软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、肝样细胞、上皮细胞和胰岛细胞。严会文等[11]通过分散酶联合胰酶法分离得到大鼠LSCs，并发现在20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF细胞因子作用下，LSCs具有分化为神经干细胞样细胞的能力，同时联合使用RA可促进LSCs向神经干细胞样细胞分化。因此，LSCs可作为组织工程创伤修复、细胞移植、支持造血、基因治疗等研究的前体细胞，具有广阔的临床应用前景[12]。此外，试验研究和临床观察表明，当角膜缘上皮部分缺失[13-14]或完全缺失[15-16]时，角膜上皮伤口愈合异常，会出现结膜化、血管化和慢性炎症，造成严重的视力障碍[17]。LSCs可以进一步分化为角膜上皮细胞，在临床上可用于重建角膜缘干细胞缺陷患者的整个角膜上皮[18-19]﹐然而角膜缘移植存在供体短缺的问题，因此，如何用体外培养的LSCs构建组织工程化的人工角膜上皮，并通过移植治疗严重的眼表疾病成为近年来研究的热点[20-21]。目前对于LSCs的研究以人源LSCs为主[22]，也有少量羊[23]、兔[24]、鼠[11]和猫[6]等来源。北京油鸡是一种优秀的中国本土品种，2001年被农业部列为国家级畜禽品种资源重点保护品种[25]。本试验用10胚龄北京油鸡鸡胚角膜缘组织分离培养细胞，探究北京油鸡LSCs体外分离培养、成骨、成软骨分化潜能等生物学特性，以期为角膜损伤的治疗提供新的思路。
1.1 材料
1.1.1 试验动物 10胚龄健康北京油鸡鸡胚由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平实验基地种禽场提供。
1.1.2 主要试剂 bFGF、EGF、胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS-G)、分散酶Ⅱ(dispaseⅡ)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、胰蛋白酶、地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、谷氨酰胺(Gln)均购自Sigma公司；
FBS、GlutaMAXTM添加剂、DMEM/F12培养基、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA二钠盐)均购自Gibco公司；
茜素红、阿利新蓝、油红染色试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；
p63、ABCG2、CK19和CK3/CK12单克隆抗体均购自Abcam公司；
山羊抗兔FITC标记二抗、山羊血清均购自北京中山金桥生物技术有限公司；
多聚甲醛来自北京化工厂；
Trizol购自Invitrogen公司；
反转录试剂盒、PCR MasterMix均购自TaKaRa公司。
1.2 细胞的分离培养和传代
取10胚龄北京油鸡鸡胚，钝性剥离眼周皮肉及筋膜组织，取出完整眼球后用含青-链霉素的PBS清洗。沿角膜缘环形剪开结膜和结膜下筋膜后﹐沿角膜缘内外各1 mm环形剪取角膜缘组织，将剪下的角膜缘组织放入含青-链霉素的PBS中。将剪下的角膜缘组织剪成1 mm3的组织块，用含青-链霉素的PBS反复冲洗，加1.2 U/mL分散酶Ⅱ，37 ℃消化1 h，然后用0.25%胰酶消化10 min，用含10% FBS的DMEM/F12培养基终止消化。1 200 r/min离心10 min，弃上清，沉淀加培养基反复吹打混匀，过200目筛，将细胞密度调整为1×106/mL，接种到60 mm培养皿中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。当细胞汇合至80%时，吸弃培养基，PBS洗2次，用0.25%胰蛋白酶消化，观察细胞形态，当有大量细胞收缩变圆发亮时，用完全培养基(DMEM/F12+10% FBS+1% Gln+1% ITS-G+10 ng/mL bFGF+20 ng/mL EGF)终止消化，按1∶2的比例进行传代，于37 ℃、5% CO2培养箱内培养。
1.3 生长曲线绘制
取培养至第5、15、25代生长状态良好的细胞，用0.25%的胰酶消化后用完全培养基配成单细胞悬液，按1×104/mL接种于24孔板中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每天随机取3孔细胞计数并计算均值，连续7 d。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制生长曲线。根据曲线计算可得细胞的群体倍增时间(population doubling time,PDT)。
PDT=(t-t0) lg2/(lgNt-lgN0)
式中，t为对数生长期结束时间；
t0为对数生长期开始时间；
Nt为对数生长期结束时细胞数量；
N0为对数生长期开始时的细胞数量。
1.4 免疫荧光检测表面标记物
取培养至第2代的细胞，当细胞汇合度达60%时，弃培养基，PBS洗3次。用4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次。用0.25% Triton X-100通透15 min，PBS洗2次。10%山羊血清封闭1 h。弃封闭液，加入兔抗鸡ABCG2(1∶100)、p63(1∶100)、CK19(1∶100)单克隆一抗，4 ℃孵育过夜。PBS洗3次，避光加入FITC标记的山羊抗兔lgG (1∶100)二抗，室温孵育1 h，PBS洗3次，1 μg/mL DAPI避光染核20 min，PBS洗3次。用激光扫描共聚焦显微镜(TE-2000-E，Nikon公司)观察并拍照。
1.5 RT-PCR检测表面标记物
选取第5、15和25代细胞，用Trizol法提取细胞总RNA并反转录合成cDNA。根据GenBank中p63、CK19、ABCG2、CD45、骨桥蛋白(OPN)、Ⅰ型胶原蛋白(Col-Ⅰ)、性别决定区Y框9(Sox9)、Col-Ⅱ和GAPDH基因的序列，用Oligo软件和NCBI-BLAST设计特异性引物，引物信息见表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系25 μL：dNTP(2.5 mol/L) 2 μL，上、下游引物各1 μL，10×Buffer 2.5 μL，cDNA模板1.5 μL，EX-TaqHS 0.25 μL，ddH2O 16.75 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；
94 ℃变性30 s，退火(退火温度见表1)30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；
72 ℃延伸10 min。PCR产物用1.6%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
表1 引物信息
1.6 成骨诱导分化及鉴定
当第6代细胞汇合度达80%～90%时，随机分为诱导组和对照组。对照组用完全培养基培养，诱导组用成骨细胞诱导液(10 mmol/L地塞米松+10 mmol/L β-甘油磷酸钠+50 mg/L抗环血酸+10% FBS+DMEM/F12)培养，每3 d换1次诱导液。诱导21 d后进行茜素红染色。按1.5中RT-PCR方法检测骨细胞特异性基因OPN和Col-Ⅰ的表达情况。
1.7 成软骨诱导分化及鉴定
当第6代细胞汇合度达70%时，随机分为诱导组和对照组，对照组用完全培养基培养，诱导组用成软骨细胞诱导液(DMEM/F12+10% FBS+0.1 μmol/L地塞米松+10 ng/mL TGF-β1+0.9 mmol/L丙酮酸钠+50 μg/mLL-脯氨酸+50 μg/mL 维生素C+1% ITS)培养，每3 d换1次诱导液，诱导21 d后进行阿利新蓝染色。按1.5中RT-PCR方法检测软骨细胞特异性基因Sox-9和Col-Ⅱ的表达。
2.1 细胞生长特性
2.1.1 细胞形态 用分散酶Ⅱ联合胰酶法消化角膜缘组织获得的细胞接种培养15 h后为圆形或不规则形状并开始贴壁。细胞贴壁后生长很快，2～4 d成片生长，5～6 d汇合成单层(图1A)。传代培养时，细胞贴壁时间较原代细胞短，12 h内可见大量细胞贴壁，细胞形态呈多角形(图1B)，传至第10代时细胞形态无明显改变(图1C)，细胞仍具有较强的增殖活力。随着传代次数的增多，细胞贴壁时间延长，细胞体积增大，胞内空泡增多，脂褐质沉积增多，增殖活力逐渐下降，细胞逐渐变扁变长(图1D)。
A，培养15 h的原代细胞；
B，培养5～6 d的原代细胞；
C，第10代细胞；
D，第24代细胞
2.1.2 生长曲线及群体倍增时间 由图2可知，第5和10代细胞生长状况相近，第0～2天细胞处于潜伏适应期，第3～5天快速增殖，进入对数生长期，第5～7天达到平台期，第7天后进入衰退期。第20代细胞第0～2天也处于潜伏期，但潜伏期后，细胞增殖能力与第5和10代细胞相比明显下降，到达平台期的细胞明显减少。第5、10和20代细胞的群体倍增时间分别为34.14、37.38和39.37 h。
图2 分离细胞的生长曲线
2.2 分离细胞的鉴定
2.2.1 免疫荧光检测表面标记物 由图3可知，分离的细胞表达LSCs特异性表面标记物p63、ABCG2和CK19，不表达CK3和CK12，符合LSCs特异性，表明分离的细胞为LSCs。
图3 分离细胞表面标志物免疫荧光检测(40×)
2.2.2 RT-PCR检测LSCs表面标志物 由图4可知，分离的北京油鸡LSCs表达p63、CK19和ABCG2，不表达CD45。
M，DL1000 DNA Marker；
1～5，GADPH-1、ABCG2、p63、CK19、CD45基因
2.2.3 成骨诱导分化 与对照组(图5A)相比，在成骨培养基中培养21 d的北京油鸡胚胎LSCs有矿化钙结节产生，并且积累的钙结节可被茜素红S(阳性)染红(图5B)。RT-PCR检测结果显示，诱导后的北京油鸡LSCs高表达成骨关键基因OPN和Col-Ⅰ，而在对照组细胞中则未检测到这2个基因(图5C)。
①A，对照组细胞茜素红S染色(40×)；
B，诱导组细胞茜素红S染色(40×)；
C，骨细胞RT-PCR检测。②M，DL1000 DNA Marker；
1～3，诱导组GAPDH-2、OPN和Col-Ⅰ基因；
4～6，对照组GAPDH-2、OPN和Col-Ⅰ基因
2.2.2 成软骨诱导分化 与对照组(图6A)相比，在软骨形成培养基中孵育21 d的北京油鸡胚胎LSCs有软骨组织产生，并且可被阿利新蓝染成蓝色(图6B)。RT-PCR结果表明，诱导后的北京油鸡LSCs表达成软骨关键基因Col-Ⅱ和SOX-9，而对照组细胞中则未检测到这2个基因(图6C)。
①A，对照组细胞阿利新蓝染色(40×)；
B，诱导组细胞阿利新蓝染色(40×)；
C，软骨细胞RT-PCR检测。②M，DL1000 DNA Marker；
1～3，诱导组GAPDH-2、Col-Ⅱ、SOX-9基因；
4～6，对照组GAPDH-2、Col-Ⅱ、SOX-9基因
LSCs的分离方法主要有组织块贴壁法和酶消化法，酶消化法是从组织中分离干细胞的稳定方法[26]，而组织块贴壁法耗时较长，且由于鸡胚的角膜缘组织较其他器官组织坚硬，分离率较低，故本试验采取分散酶Ⅱ联合胰酶法消化北京油鸡鸡胚角膜缘组织获得细胞，此方法得到的细胞产量高，培养成功率高。鸡胚的眼球在孵化至第5天时出现黑色素，形成淡灰色圆圈[27-28]，第7天时眼球增大，第10天瞬膜和眼睑出现，至第18天时睁眼[29]。10胚龄时眼球各部分已完整形成，且组织柔软，便于消化，可分离出大量细胞。随着胚龄的增大，眼球组织变硬，经过分散酶Ⅱ联合胰酶消化后仍无法获得大量细胞，故本试验选择10胚龄北京油鸡鸡胚为研究对象。免疫荧光和RT-PCR鉴定结果均表明，分离的北京油鸡LSCs中ABCG2、p63和CK19均呈阳性表达，符合LSCs的特性[30]。
研究表明，干细胞具有巨大的自我更新和增殖能力[31-32]。LSCs是具有自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，负责角膜上皮的更新，而角膜上皮完整性对于维持最佳视力所需的角膜透明度至关重要。分离的北京油鸡LSCs在体外培养传代26次，且第5、10、20代LSCs的生长曲线均表现出S形，说明细胞均经历了潜伏适应期、对数生长期和平台期这3个正常的细胞生长周期[33]。刚开始培养时，由于细胞密度低及由酶引起的损伤的恢复，LSCs的生长速度极慢，经过2～3 d的潜伏适应期后，LSCs迅速增殖并进入对数生长期，培养后期由于细胞密度增加和接触抑制而趋于稳定进入平台期[34]，表明分离的北京油鸡LSCs具有强大的自我更新和增殖能力，与以往的研究一致[34-37]。
除了自我更新和增殖能力，LSCs在体外还具有多向分化潜能[38]。在北京油鸡LSCs诱导成骨的培养基中，抗坏血酸盐对于胶原蛋白合成和碱性磷酸酶(ALP)活性起到了重要作用[39]。抗坏血酸可以刺激Ⅰ型胶原蛋白的产生，Ⅰ型胶原蛋白是骨中主要的蛋白质成分，为钙盐、磷盐等矿物质的沉积和矿化提供有利条件[40]，可以促进骨的形成[41]。β-甘油磷酸钠可以提供磷，磷是ALP的反应底物，可以促进结节钙化[42]。地塞米松对成骨分化具有重要的调控作用，高浓度的地塞米松可以促进碱性磷酸酶的形成[43]。本试验成骨诱导液中添加抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松，成功诱导北京油鸡LSCs向成骨方向分化，诱导21 d后细胞产生明显的钙结节，可被茜素红S染成红色，且诱导的细胞表达成骨关键基因OPN和Col-Ⅰ，而未添加诱导液的对照组细胞不表达这些基因。在北京油鸡LSCs诱导成软骨的培养基中添加了TGF-β1、地塞米松、抗坏血酸和丙酮酸钠等。TGF-β1可在体外诱导干细胞向软骨方向的分化，这个过程需要细胞-细胞和细胞-基质的作用，并涉及多个信号网络的协调[44]。TGF-β1可以促进Ⅱ型胶原蛋白的合成。诱导21 d后，可见被阿利新蓝染蓝的软骨组织，且诱导的细胞表达成软骨关键基因SOX-9和Col-Ⅱ，而未添加诱导液的对照组细胞不表达这些基因。证明LSCs具有成骨和成软骨的分化潜能，可以分化为多个胚层的细胞，同时表明LSCs的分化方向是由不同的诱导培养基决定的。
LSCs移植(LSCT)在治疗角膜缘干细胞缺失症和角膜烧伤等疾病中受到越来越多的关注，但供体组织的可用性仍然是影响所有移植的主要限制。目前关于LSCs异种移植的报道较少，如将兔来源LSCs移植到人的角膜上[46]，将大鼠来源LSCs移植到小鼠角膜表面损伤模型中[45]，将人来源LSCs移植到LSC缺陷小鼠模型中[47-48]，将兔来源LSCs移植到小鼠角膜碱烧伤模型中[49]，都证明LSCs能通过下调炎症因子表达、上调抗炎因子表达等方式促进角膜损伤愈合，提高烧伤后角膜的透明度，甚至具有完全恢复角膜的能力[50]。有研究者推测来自转基因猪的角膜或细胞的异种移植可能成为人类LSCs供体缺乏的解决方案之一[51]，禽类相比于猪来说养殖成本更低，取材也更方便，但尚未发现关于移植禽类LSCs治疗角膜损伤或疾病的报道，未来禽类也许会成为更加合适的LSCs供体来源。
本试验从10胚龄北京油鸡鸡胚中成功分离LSCs，且LSCs表达ABCG2、p63、CK19基因，不表达CK3、CK12基因及造血干细胞特异性基因CD45，LSCs可以诱导分化为成骨和成软骨细胞。
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