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邵一鸣，张濛，张新安，连鸿凯
1.郑州大学第二附属医院骨科，河南 郑州 450014；
2.郑州大学附属郑州中心医院骨科，河南 郑州 450001；
3.河南省人民医院骨科，河南 郑州 450003
骨关节炎是一种严重影响中老年人生活质量的关节退行性疾病。其主要特点为关节软骨退变、滑膜炎症和关节间隙变窄，临床表现为关节疼痛肿胀、活动受限及畸形改变[1-3]。据估计，全球约有3亿人患有骨关节炎，这是导致老年人残疾的主要原因之一[4-5]。因此，早期诊断和治疗可以延缓骨关节炎的进展[6]。目前，临床治疗早期骨关节炎以口服药物为主，如糖皮质激素类、非甾体类消炎药、阿片类镇痛药和对乙酰基酚类药物[7-8]。这些药物仅仅针对疾病的症状，并没有从根本上改变骨关节炎的病理状况，而且还伴有一系列药物不良反应，如胃肠毒性、肝肾损伤和心血管损伤等[9-10]。因此，寻找一种更安全、更有效治疗骨关节炎的药物具有重要意义。
槲皮素是一种广泛分布于植物界的黄酮类化合物，具有抗氧化应激、抗炎、免疫调节等多种作用[11]。研究表明，槲皮素可以通过抑制IRAK1/NLRP3信号通路进一步抑制白细胞介素-1β诱导的炎症反应和细胞凋亡，减轻大鼠关节软骨的退化和侵蚀[12]。但由于槲皮素治疗骨关节炎的疗效受多种途径调节，机制较为复杂，常用的药理学方法难以对其进行系统分析。网络药理学可以通过高通量筛选、网络可视化、网络拓扑分析等方法揭示成分、靶点和疾病之间复杂的网络关系，准确预测和分析其潜在的作用机制[13]。因此，本研究旨在利用生物信息学分析和分子对接技术阐明和验证槲皮素治疗骨关节炎的分子作用机制，为其临床应用和基础研究提供科学的理论依据。
1.1 槲皮素结构及靶点的获取使用中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP，https：//tcmsp-e.com/)获取槲皮素的结构及其靶点信息，并通过UniProt 数据库(https：//www.uniprot.org/)将靶点转换为相对应的人源基因名。
1.2 骨关节炎疾病靶点获取使用基因表达综合数据库(gene expression omnibus，GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载与骨关节炎相关的高通量测序数据。在数据库中以"osteoarthritis"为关键词检索，筛选得到编号为GSE82107的全基因组测序数据。该数据中含有17个样本，其中包括7例正常膝关节滑膜组织标本和10例终末期骨关节炎患者膝关节滑膜组织标本。上述所有测序数据集均基于GPL570平台的GEO数据库下载。利用R软件的"limma"包进行两组之间的差异性分析，设置|log2(FC)|>1，校正后P值<0.05，筛选出数据中具有差异表达的基因，差异分析结果以火山图及热图的形式进行可视化展示。此外，在GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)中以"osteoarthritis"为关键词进行检索，将其检索所得的疾病靶点作为补充。
1.3 槲皮素治疗骨关节炎的潜在作用靶点预测使用在线软件VRNNY2.1(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)对上述所得的槲皮素靶点和骨关节炎疾病靶点进行映射，得到两者的交集靶点，并绘制韦恩图。
1.4 蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络的构建及核心靶点的筛选通过STRING在线数据库(http：//string-db.org/)对交集靶点进行分析，在中置信度(0.700)处设置所需的最低相互作用分数，并隐藏游离靶点，构建靶点PPI网络，导出PPI数据。将上述数据导入 Cytoscape 3.8.2 软件(http：//www.cytoscape.org)，对该PPI网络进行拓扑分析和核心靶点筛选，其中核心靶点的筛选条件为该网络中的节点度、中介中心性及接近中心均大于其平均值。
1.5 “槲皮素-交集靶点-骨关节炎”对应关系网络构建为了更加清晰地呈现槲皮素与骨关节炎之间的对应关系，使用Cytoscape 3.8.2 软件绘制“槲皮素-交集靶点-骨关节炎”网络图。
1.6 富集分析将1.4筛选到的核心靶点提交至Metascape在线数据库(https：//metascape.org/)，进行基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析、京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，其中KEGG分析中设置P<0.05，得到槲皮素治疗骨关节炎相关的生物学功能和信号通路。
1.7 分子对接在Pubchem在线数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载槲皮素的2D结构，使用OpenBabel软件转化为mol2格式。随后从蛋白质数据库(protein data bank，PDB，https：//www.rcsb.org/)下载PPI网络中度值靠前的靶点的配体PDB格式文件，采用PyMOL软件去除其中的水分子和配体分子，在SwissDock网站(http：//www.swissdock.ch/)分别上传以上得到的结构文件进行分子对接。
2.1 槲皮素的结构及相关靶点通过TCMSP数据库检索得到140个槲皮素对应靶点。槲皮素相关信息详见表1。
表1 槲皮素的结构及信息
2.2 骨关节炎疾病靶点的获取对编号为GSE82107的数据进行差异性分析后，得到1 745个与骨关节炎发生发展有显著影响的基因，其中上调基因369个，下调基因1 376个，分析结果见图1。同时，在GeneCards数据库中获得骨关节炎相关基因3 211个，两者合并去重后共得到骨关节炎相关靶点4 746个。最后映射出槲皮素治疗骨关节炎的潜在作用靶点104个，见图2。
图1 GSE82107差异性分析的热图及火山图
2.3 交集靶点PPI网络的构建及核心靶点的筛选使用STRING在线数据库构建交集靶点PPI网络，网络中包含100个节点和719条边。以“节点度值”“中介中心性”和“接近中心性”3个主要参数筛选关键基因，筛选阈值为节点度值≥ 14.38，中介中心性≥0.013，接近中心性≥0.447，筛选后剩余26个节点和287条边。筛选过程见图3。
图2 槲皮素-骨关节炎交集靶点韦恩图
2.4 “槲皮素-交集靶点-骨关节炎”网络构建采用Cytoscape 3.8.2软件构建 “槲皮素-交集靶点-骨关节炎”对应关系网络，见图4。网络图中黑色节点代表靶点，红色节点代表“槲皮素”，蓝色节点代表“骨关节炎”，线条代表槲皮素、骨关节炎与靶点具有对应关系。
2.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析为了进一步系统地阐明槲皮素治疗骨关节炎的机制，采用Metascape数据库对26个核心靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。选取P值排列前10位的结果分别以气泡图进行可视化展示。GO功能富集分析获得了928个结果，其中包括生物学过程(biological process，BP)863个、细胞组成(cellular component，CC)26个、分子功能(molecular function，MF)39个。GO功能富集分析表明，生物过程主要集中于对肿瘤坏死因子、脂多糖、凋亡信号通路等调节；
细胞成分主要集中在膜筏、质膜蛋白复合物、转录调节因子复合体中；
分子功能主要表现为细胞因子受体结合、蛋白激酶结合和肿瘤坏死因子受体超家族结合等，见图5。KEGG通路富集分析得到111条相关通路，主要包括癌症相关通路、PI3K/AKT信号通路、凋亡、NF-κB信号通路等，详见图6。
图3 槲皮素治疗骨关节炎的PPI网络拓扑分析图
图4 槲皮素-交集靶标-骨关节炎网络图
图5 GO功能富集分析
图6 KEGG通路富集分析
2.6 分子对接结果一般认为，配体与受体结合稳定时的结合能越低，发生作用的可能性越大；
当结合能≤-5.0 kcal·mol-1时，两者具有良好的亲和力。分子对接结果显示：槲皮素与关键靶点之间的结合能均<-5.0 kcal·mol-1，与肿瘤坏死因子、MYC、AKT1的结合能分别为-7.36、-6.96、-7.31 kcal·mol-1。由此表明，槲皮素与治疗骨关节炎的关键作用靶点具有较好的结合活性，见图7。
图7 槲皮素与肿瘤坏死因子、MYC、AKT1的分子对接模式图
在天然化合物中，黄酮类化合物已成为治疗多种疾病的潜在候选药物。槲皮素是一种存在于多种水果和植物中的黄酮类多酚化合物，具有预防和治疗心血管疾病、神经退行性疾病以及癌症等作用[14]。研究表明，槲皮素可以通过抑制SIRT1/AMPK介导的内质网应激进一步抑制大鼠软骨细胞氧化应激诱导的细胞凋亡，达到减轻关节软骨退变的效果[15]。另外，槲皮素还可以通过抑制软骨细胞的炎症和凋亡调节滑膜巨噬细胞向M2巨噬细胞的极化，为软骨细胞创造有利环境，促进软骨修复，从而发挥软骨保护作用[16]。但是由于槲皮素通过多途径、多靶点的特点作用于骨关节炎，更多的作用机制还有待于进一步研究发现。
笔者从PPI网络中筛选到了肿瘤坏死因子、AKT1、MYC、CCND1、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)等26个槲皮素治疗骨关节炎的核心靶点。肿瘤坏死因子-α是一种由包括巨噬细胞在内的多种细胞产生的炎症细胞因子。在骨关节炎的发生发展过程中，肿瘤坏死因子-α通过抑制蛋白多糖的合成和刺激基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)的产生引起关节软骨不稳，从而导致关节软骨的降解[17]。肿瘤坏死因子-α还可以刺激促炎和促代谢介质的合成，如MMP-1、MMP-3、白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)、IL-8等，这些介质均在引起关节炎症、降解软骨基质蛋白过程中发挥重要作用[18]。当阻断肿瘤坏死因子-α受体时可明显抑制软骨中一氧化氮的产生，而一氧化氮是滑膜组织中潜在的凋亡介质。此外，肿瘤坏死因子-α还可以直接或间接激活TLR信号级联反应引起细胞凋亡[19-20]。MYC基因是一组致癌基因，其家族成员包括C-myc、N-myc和L-myc。研究发现，C-myc基因沉默可以促进细胞增殖并抑制IL-1β诱导的大鼠软骨细胞中的细胞凋亡和细胞因子表达[21]。EGFB在健康的关节软骨中高度表达，它可以促进关节中滑液的分泌，保持软骨表面润滑以及提高关节软骨机械强度。EGFR活性的降低会导致关节软骨在发育过程中产生结构、功能和机械方面的损害，并在骨关节炎的病理过程中显著加速软骨退化[22]。
通过对核心靶点的GO功能富集分析，发现槲皮素治疗骨关节炎的潜在靶点与骨和软骨细胞的增殖修复、细胞凋亡以及炎症机制的形成等生物学过程密切相关。软骨细胞凋亡可能是调控软骨退变的有效靶点。因为，软骨细胞活力的丧失是人类骨关节炎的一个重要标志[23]。炎症在骨关节炎的发病机制中也起着核心作用。关节软骨、软骨下骨、滑膜组织、韧带和半月板都参与了骨关节炎炎症网络的形成[24]。因此，炎症通路的靶向治疗可能为未来骨关节炎的临床治疗提供新思路。
KEGG通路富集分析结果显示，槲皮素治疗骨关节炎的关键通路为PI3K/AKT信号通路、凋亡和NF-κB信号通路。PI3K/AKT是一条非常重要且相当复杂的信号通路，它在许多细胞稳态过程中都发挥重要作用，包括细胞周期、细胞存活、炎症、新陈代谢和凋亡等[25-26]。同时，PI3K/AKT信号通路也是软骨细胞存活和凋亡的重要调节因子[27]。大量研究表明，多种生长因子和生物活性物质可通过激活PI3K/AKT信号通路减少软骨细胞凋亡，从而发挥骨关节炎保护作用，如胰岛素样生长因子-1、血小板衍生生长因子BB、委陵菜酸等[28-29]。NF-κB信号通路不仅参与调控软骨正常发育和病理破坏，而且是骨关节炎相关炎症介质的主要调节因子，其主要由IKB激酶介导的IkBa降解和RelA磷酸化所激活[30-31]。活化的PI3K/AKT还可以参与NF-κB p65的磷酸化和核转位，促进炎症介质的产生[32]。由此可见，槲皮素可以通过以上关键通路及靶点调节骨关节炎过程中的炎症、免疫、凋亡等达到防治骨关节炎的效果。
最后，本研究通过分子对接技术验证了槲皮素与肿瘤坏死因子、AKT1、MYC之间的结合能力。结果显示，槲皮素可分别与肿瘤坏死因子、AKT1、MYC形成稳定的对接模型，这进一步证实了之前的推测结果。
综上所述，本研究采用生物信息学方法对槲皮素治疗骨关节炎的作用机制进行了综合分析，结果提示槲皮素对骨关节炎的治疗作用是通过“多靶点、多途径”的特点在抗炎、抑制软骨细胞凋亡方面发挥协同作用。这与现有的研究结果相互吻合，为今后槲皮素的药理机制分析提供了数据支持，但本研究结果还需要后续进一步的实验研究加以验证。
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