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温才宁，欧阳侃，周晓莹，秦转，王大平*，段莉*
1.广州医科大学研究生院，广州 511436；
2.深圳市第二人民医院组织工程重点实验室，广东 深圳 518035
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨退变为主的慢性运动系统疾病，严重影响患者的运动功能[1]。OA是一个逐步退化的过程。在OA早期，软骨细胞外基质会被破坏，此时软骨细胞的活性加强，意味着机体尝试修复受损基质。随着炎症级联反应及分解代谢的作用，胶原蛋白网络被侵蚀破坏，蛋白聚糖被分解消耗，软骨细胞大量死亡，OA 进入不可逆的受损状态[2]。关节软骨病损的修复已成为运动医学领域的热点和难题[3,4]。为此已开展大量的体外和体内研究工作。基于细胞水平开展的体外实验设定的条件标准化和均一化，难以模拟反映在复杂的体内环境中药物的代谢及疗效[5]。动物实验研究存在周期长、需专用动物饲养空间和人员和研究投入成本高等局限性。此外，通过动物实验研究不能实时监测药物在软骨组织内的分布代谢。因此，亟需建立一种研究模型，该模型既简单经济，又可高度模拟骨关节炎患者关节软骨病损修复过程，实时监测药物在软骨组织内的动态变化。KGN 是一种小分子，目前已经发现KGN 在体内和体外均可诱导间充质干细胞向软骨分化，能够达到令人满意的治疗OA 效果[6]。KGN 已然成为治疗OA 的代表性药物。本研究团队在研究KGN 治疗OA 上取得一定了成果。软骨组织由丰富的胶原蛋白网络构成，使得药物较难渗入受损部位。本团队研究聚焦于OA 早期阶段，希望药物能在早期发挥作用控制OA 进展。因此选择健康猪的股骨软骨，模拟在较完整的软骨屏障上药物的渗透情况。
1.1 试剂及材料
实验动物猪为健康雄性五指山小型猪，25 kg，来源于有实验动物生产许可证的单位，在符合实验要求的环境饲养；
DMEM 培养液、青霉素/链霉素双抗（GIBCO，美国）；
KGN（Selleck，美国）；
Rhodamine B -KGN（实验室合成）；
甲苯胺蓝溶液（北京索莱宝科技有限公司）；
4.0 mm 活检组织穿孔器（Miltex，日本）；
CO2培养箱、冰冻切片机（Thermo Fisher Scientific，美国）；
激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss AG，德国）。
1.2 实验方法
1.2.1 猪关节软骨外植体的获取与体外培养 无菌条件下，用40 mm 活检组织穿孔器钻取新鲜的猪关节软骨组织，将获取到的4.0 mm 猪关节软骨外植体接种到48孔板中，每孔放置1个外植体，添加0.5 mL DMEM 培养液，37 ℃，5%CO2条件下培养。
1.2.2 Rhodamine B-KGN 合成 商品KGN 经化学修饰先合成中间化合物：tert-butyl (2-(2-(2-(2-([1,1"-biphenyl]-4-ylcarbamoyl) benzamido) ethoxy) ethoxy)ethyl) carbamate；
中间化合物再经过修饰成Rhodamine B-KGN：N1-([1,1"-biphenyl]-4-yl)-N2-(2-(2-(2-(3",6"-bis(diethylamino)-3-oxospiro[isoindoline-1,9"-xanthen]-2-yl)ethoxy)ethoxy)ethyl)phthalamide。具体的合成及验证步骤本团队已发表在《Biomaterials》上[6]。
1.2.3 猪关节软骨外植体的药物渗透标记 实验分成3 组：药物渗透12 h 组、24 h 组、48 h 组，每组3 个样本，于体外培养24 h 后加入Rhodamine B -KGN（1 μmol/L），37 ℃、5% CO2条件下继续培养相应时间，冰冻切片，在激光共聚焦显微镜下观察KGN 在软骨组织内的渗透分布情况。
1.3 统计学处理
采用GraphPad Prism 8 进行统计学分析。组间比较使用one-way ANOVA进行分析。
2.1 软骨外植体获取
用活检组织穿孔器获取猪关节软骨外植体，呈圆柱状，表面光滑无破损，直径为4.0 mm（图1）。
图1 外植体直径测量Fig.1 Explant diameter measurement
2.2 Rhodamine B-KGN在软骨细胞中的渗透结果
激光共聚焦显微镜下观察冰冻切片，结果显示，药物渗透12、24、48 h 组的猪关节软骨外植体，组织为均匀的软骨组织、软骨陷窝中可见清晰完整的软骨细胞（图2）。荧光结果显示，Rhodamine B -KGN 呈红色荧光，Image J 结果如表1 所示，统计分析见图3，48 h 组荧光强度明显增强（P＜0.01），随着时间推移，渗透进入软骨细胞的Rhodamine B -KGN 明显递增。以上结果提示，猪关节软骨外植体无血清培养模型在体外48 h 内可维持正常形态结构，且小分子药物在组织渗透递送到软骨细胞中。
图3 荧光强度统计分析Fig.3 Statistical analysis of fluorescence intensity
表1 Rhodamine B-KGN荧光强度分析Tab.1 Fluorescence intensity analysis of Rhodamine B-KGN
图2 激光共聚焦显微镜观察外植体冰冻切片小分子药物渗透情况(标尺=50 μm)Fig.2 The permeation of small molecule drugs in frozen sections of explants was observed by confocal laser microscope（bar=50 μm）
目前，小分子化合物已成为骨关节炎药物研发领域的一个热点。其中，KGN 是由Johnson 等[7]从22 000多种结构不同的杂环类药性分子中筛选出的一种小分子化合物，体外细胞实验表明KGN 能有效地促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，进一步的动物实验研究提示KGN 可有效修复关节软骨病损，从而发挥保护关节软骨的效应[6～8]。
为突破体外细胞实验和动物在体实验的局限性[9]，本研究通过体外无血清培养软骨外植体，利用Rhodamine B标记KGN，再进行小分子药物递送渗透能力的检测，动态示踪小分子药物递送进入软骨组织的全过程。组织学观察显示，体外培养的软骨外植体可维持软骨组织及软骨陷窝内的软骨细胞的正常形态，且KGN可进入软骨组织内部。由于关节软骨是一种无血管、神经和淋巴的组织，其基膜由高密度的胶原纤维网、蛋白聚糖和其他细胞外大分子构成[10]；
在体外培养条件下，小分子药物可避免受到体内关节的滑膜清除和血液及淋巴循环系统的影响[5]。因此，本项研究结果提示在体外培养的软骨外植体模型中，无组织靶向性的小分子药物可渗透进入致密的软骨组织，进而发挥修复软骨病损的效应。
更重要的是，本研究建立的猪软骨外植体体系，猪软骨厚度为0.5～2.0 mm，与骨关节炎期间退化的人软骨厚度极为接近[11]，是开展关节软骨相关研究工作的理想模型。此外，该离体软骨可取材于其它实验完成后的动物，符合节约实验成本，最大程度减少动物数目、关心动物福利的实验原则。因此，本研究为开展药物递送对关节软骨病损的作用及其在骨关节炎治疗中的应用提供一种简单经济的研究策略，可在基础研究、药物研发和高通量筛选等领域推广应用。
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