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孙玲伟， 何孟纤， 戴建军， 吴彩凤， 张德福， 林月霞
（上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106）
我国绵羊和山羊的饲养量、出栏量、肉产量、皮产量和绒产量均居世界前列。原产于我国太湖流域的湖羊，具有易舍饲、早熟、四季发情、一年二胎且多羔等优良性状，越来越受到市场青睐[1]。生产中，往往由于其多胎性易造成妊娠期营养摄取不足，导致新生羔羊出现宫内生长受限（intrauterine fetal growth restriction, IUGR）[2]。IUGR是胎儿在母体内发育障碍的总称，主要指新生儿的出生体质量低于同孕龄平均出生体质量的2个标准差或低于10%，主要表现为新生儿体质量和组织器官轻，肌肉系统、胃肠道系统或其他组织器官形态和功能发育不完善，不仅严重影响动物的健康，也给畜牧生产造成极大的损失[3]。IUGR一直是哺乳动物常见的产科并发症之一，且多胎动物的发生概率高于单胎动物，生产中绵羊和猪的IUGR 现象尤为严重[4]。IUGR 新生羔羊往往自身体质较差、生命力弱，不仅增加羊场管理难度，也易引起母羊繁殖和饲料资源的浪费。针对IUGR，目前主要关注其对胎儿或新生儿组织器官的影响，或IUGR 的早期诊断和治疗[5-6]。然而，新生儿的营养代谢是个复杂的动态系统，涉及多种物质的代谢进程，需要全景式地展现体内代谢变化，且IUGR 新生羔羊与健康羔羊间的代谢区别也尚需深入研究。
作为代谢组学的主要技术平台之一，一维氢谱核磁共振（proton nuclear magnetic resonance spectra ，1H-NMR）能够对生物的血液、尿液、乳汁等体液以及多种器官组织样本进行分析，将正常生理状态与病理状态下多种小分子代谢物的表达差异进行分析，并对物质进行分离和鉴定，进一步通过生物信息学方法将研究中相关的外源性或内源性影响因素相结合，从而建立一定的生物学联系[7]。1H-NMR 技术可以在同一时间得到多种分子信息，不仅检测样品需要量少，且具有良好的检测重现性。目前，1H-NMR 已被广泛应用于生物的代谢轮廓、药物的作用机理、疾病的早期预防和诊断等多学科领域。Dessi 等[8]指出，新生儿的代谢异常可以通过应用该技术全景式地阐释代谢异常 过 程 。Sanz-Cortés 等[9]也 通 过1H-NMR 揭 示 了IUGR 新生儿脐静脉血浆的特征性代谢变化。尽管已有许多关于新生儿的代谢组学研究报道，但有关绵羊新生IUGR 羔羊的血液代谢组较少。因此，本研究拟应用1H-NMR 技术分析IUGR 新生羔羊的血液样品，旨在筛选IUGR 羔羊的特征性代谢物，从而全面了解IUGR 引起新生羔羊的机体代谢变化，对提高湖羊生产和繁殖性能具有积极的意义。
1.1 供试材料
本试验在上海市永辉羊业有限公司开展，选取（20.43±0.23）月龄和体质量（42.29±3.78）kg 的2～3 胎经产母羊，分别于 2021年 1—6月采集其分娩记录以及新生活羔体质量，计算所有健康新生羔羊的平均体质量和标准差，以出生质量低于平均体质量2个标准差作为标准[10]选择IUGR 羔羊。2018年7月，通过对适龄母羊进行同期发情与人工授精技术，随机选取正常出生体质量羔羊（normal birth weight，NBW 组）和IUGR 羔羊（IUGR组）各7只。
1.2 样品制备
新生羔羊按照体质量分为NBW组和IUGR组，在出生1 h 内采集其颈动脉血液样品，于室温、3 000 r·min-1离心 10 min 后，将分离的血浆样品分装后贮存于-80°C冰箱待测。
将样品在室温下解冻后，每份取400 μL 血浆样品中加入重水 200 μL（含 0.05% TSP），涡旋震荡 30 s，4 °C、12 000 r·min-1离心 10 min。最后取550 μL上清液至5 mm 核磁共振管，待样品充分平衡后进行下一步检测。
1.3 样品1H NMR分析
将所有样品应用600 MHz超导核磁共振谱仪（德国布鲁克公司）采集数据。使用自旋回波模块采集小分子信息，使用脉冲序列采用预饱和模块压制血浆样品中的水峰[11]。检测谱宽8 000 Hz，扫描64 次，弛豫延迟2 s，采集自由感应衰减信号96次，采样间隔时间40 s。
1.4 1H-NMR数据处理
应用MestReNova 软件对获得的1H-NMR 谱进行傅里叶自动变换，对每个样品进行相位和基线调整；
对每个样品的谱图进行峰对齐，将TSP的化学位移定标（δ 0.00）[12]。通过 R 软件包（http://cran.r-project.org/）进行自动积分，积分区间 δ 为0.40～8.50，以δ 0.002 为积分间距，去除残余的水峰（δ 4.16～6.69）。最后，对谱图进行分段积分，将其进行归一化校正，用于下一步分析。
应用 SIMCA-P+软件（V12.0 Umetrics AB，Umea,Sweden）对上述标准化处理的1H-NMR数据进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），并进行验证。
1.5 代谢物鉴定与通路分析
将数据导入Chenomx NMR Suite 软件（Chenomx Inc.,Edmonton,Canada）进行谱图归属，选定匹配好峰行和位移的化合物与商业数据库（http://www.hmdb.ca 和 http://www.bmrb.wisc.edu）进行比对，确定检测的代谢物。将筛选到的NBW组与IUGR 组差异代谢物在KEGG（https://www.kegg.jp/）数据库进行代谢通路的检索。
1.6 统计分析
采用SPSS 13.0 软件对2 组新生羔羊体质量和1H-NMR 谱图检测的所有差异代谢物的峰面积平均值进行独立样本t检验。试验结果以均值±标准误（Mean±SEM）表示，P＜0.05表示差异显著。
2.1 IUGR新生羔羊体质量的变化
测定NBW 组羔羊体质量为（3.25±0.14）kg，IUGR 组体质量为（2.54±0.23）kg，IUGR 组新生羔羊的体质量比NBW 组羔羊低21.85%，说明2组新生羔羊体质量差异显著（P＜0.05），符合IUGR的定义，可用于进行后续分析。
2.2 血浆样品的1H-NMR谱图分析
NBW 组和IUGR 羔羊血液样品分别进行1H-NMR 谱的测定，经手动调相、基线校正和谱峰对齐及定标，得到血浆样本的核磁图谱。图1为NBW组和IUGR组新生羔羊血浆样品中具有代表性的1H-NMR 谱。谱图中所有信号峰包含在δ 0.40～4.15和δ 6.70～8.50，为消除残余水峰、尿素峰的影响，去掉δ 4.16～6.69 积分区间。其中，δ 6.70～8.50的区域是相对于δ 0.40～4.15的区域放大40倍以后的谱图。
图1 NBW组和IURG组血浆样品代表性的600 MHz 1H-NMR图谱Fig.1 Representative 600 MHz 1H NMR spectra of plasma samples from NBW and IURG groups
根据1H-NMR 化学位移谱库、共享数据库（KEGG、HMDB、METLIN）和组内自建数据库，对2 组血浆样品中所含代谢物进行归属和确认，共指认出32 种代谢物，主要包括糖类物质（α-葡萄糖、β-葡萄糖、乳酸、乙酸盐、N-乙酰甘露糖胺、柠檬酸、异柠檬酸）、氨基酸类物质（亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、酪氨酸、N-乙酰半胱氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、苯丙氨酸、脲基丙酸、肌肽、甜菜碱、尿甘酸）和脂类物质（1-低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、3-羟丁酸、2-羟基异戊酸酯、磷酸胆碱、甲酸、肌酸、胆碱、甘油磷酸胆碱、2-异戊酸、丙酮、丙二酸）。
比较2 组代谢指纹波谱可见，某些化学位移值处波峰水平有明显差异，表明2 组血浆代谢产物成分有明显差异。由于检测代谢物的峰值多，眼观并不是分析不同组之间差异的有效手段，所获取的信息非常有限。为了更完整地揭示2 组血浆样品的变化，需釆用多变量统计方法对复杂的数据作进一步分析。
2.3 多元统计分析
2.3.1 PCA 分析 本研究首先将2 组1H-NMR 数据采用非监督的多维统计方法进行建模，观测样品的总体代谢变化。PCA 分析后，获得2个主成分，其中第1主成分（PC1）解释原始数据中最大的变量，第 2 主成分（PC2）可以解释第2 大变量，每个点表示1个样本。PC1 和PC2 解释率分别为50.29% 和18.11%，累计解释率为68.40%。从PCA得分（图2）可以看出，NBW 组和IUGR组样本点明显分离，分布区域完全分开，且具有分别向左上和右下分离的趋势，代谢谱区别明显。这说明2 组间差异在羔羊血浆代谢组层面得到一定体现，提示相对于健康新生羔羊，IUGR 羔羊的血液代谢谱发生了改变。为进一步放大各组间的差异，采用PLS-DA 找到与IUGR 发生密切相关的代谢产物。
图2 NBW组和IUGR组新生羔羊血浆样品的PCA得分Fig.2 PCA score of plasma form newborn lambs in the NBW group and the IUGR group
2.3.2 PLS-DA 分析 PLS-DA 是一种多因变量对多自变量的回归建模方法，在代谢组学中主要用于回归建模，是模型变量筛选的有效工具。相对于PCA 可以获得更好的分类效果。利用PLS-DA采用PLS-DA 提取矩阵X（1H-NMR 数据）中的相关信息，预测变量Y（分组信息）的值，模型的模解释度（R2Y）是84%，预测度（Q2）是64%。由图3可见，2 组沿t[1]轴显著分开，呈现最大化分离，而NBW组与IUGR组内部样品比较集中，说明组内代谢差异较小。之后，对PLS-DA 模型进行500 次的排列验证，Q2和R2的回归线分别与y轴交点在负半轴和正半轴，且Q2和R2在最右端接近，说明该试验的数据模型建立成功，即2组新生羔羊的血浆样品的代谢物存在显著差异。
图3 2组新生羔羊血浆样品的PLS-DA分析Fig.3 PLS-DA plot of newborn lambs in the NBW and the IUGR groups
2.4 差异代谢物与代谢通路分析
为进一步分析NBW组与IUGR组新生羔羊的血液代谢组差异，对与IUGR 疾病相关的差异代谢物进行筛选，获得2 组间差异表达的代谢物共16个（表1）。与健康新生羔羊对比，IUGR 羔羊血浆中多个代谢物浓度发生改变，主要涉及脂代谢、氨基酸代谢、糖代谢等多条代谢通路。相较于NBW 羔羊，IUGR 羔羊血浆中多种脂代谢物均出现变化，主要包括低密度/极低密度脂蛋白（LDL/VLDL）、2-羟基异戊酸、胆碱、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱的表达上调，以及异戊酸的表达下调。IUGR 羔羊血浆中多种氨基酸和糖类含量均显著降低，主要包括葡萄糖、乳酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、酪氨酸、3-甲基组氨酸和N-乙酰半胱氨酸，进一步揭示IUGR 胎儿机体内氨基酸来源不足或利用增加。
表1 1H-NMR检测的两组间有显著变化的代谢物峰强度Table 1 Peak intensity of significantly changed metabolites between the two groups based on 1H-NMR
人类和动物流行病学研究证实，由于胎儿在母体内出现营养失衡（营养不足/过多）或代谢紊乱引发IUGR，会对其出生后的儿童和成年时期产生持续的影响，例如出现糖尿病、心血管疾病、神经精神疾病的发病风险[13]。目前，临床上IUGR预断和治疗方法皆存在不足，例如确诊时间晚、准确性不高或治疗效果差等，均会对母体和胎儿造成不利影响等。因此，掌握IUGR 的发生机制，从而获得准确性高的诊断方法和治疗方式非常重要。本研究应用代谢组学的1H-NMR 检测平台分析IUGR 新生羔羊的血液代谢组，结果显示，与健康新生羔羊对比，IUGR羔羊血浆中多个代谢物浓度发生改变，主要涉及脂代谢、氨基酸代谢、糖和能量代谢等多条代谢通路。
3.1 脂代谢分析
宫内生长的胎儿需要将获得的营养物质转化为脂肪组织，以保证出生的存活；
同时，也将脂类物质转化为能量物质，为其在宫内生长代谢提供能源。以往研究证实，IUGR胎儿在宫内脂肪合成出现抑制，引发脂质代谢紊乱[15]。
LDL 和VLDL 分别是机体内运输内源性甘油三酯和胆固醇的主要形式，IUGR胎儿的脐静脉血中LDL/VLDL 含量均高于健康新生儿，主要原因可能是由于机体内营养不足，引发体内脂质被过度动员分解[16]。胆碱及其胆碱化合物（磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱）是哺乳动物细胞双层膜的主要组成物质，本研究中IUGR 组羔羊胆碱及其胆碱化合物含量升高，表明细胞对其摄取减少而堆积在血浆中，这些改变可能引起细胞膜损伤或细胞增殖合成减慢，进一步引发某些器官生长发育受限[17]。2-羟基异戊酸是一种有机酸，在机内氧化应激状态下会升高，新生儿大脑发育异常与机体内2-羟基异戊酸的异常升高有关，也进一步提示，在IUGR新生羔羊可能会出现大脑发育异常[18]。
3.2 氨基酸代谢分析
氨基酸是胎儿生长发育的重要营养底物，一方面用于合成蛋白质进行供能，另一方面竞争性合成葡萄糖。宫内胎儿氨基酸物质的获得主要通过胎盘和胎儿间存在氨基酸的水平梯度，由母体通过胎盘转运至胎儿血液[19]。研究显示，IUGR 胎儿由于机体内营养物质不足，胎儿会优先动员自身体内氨基酸转化为能量和糖类物质，以满足自身的生长需求[20]。
亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸属于升糖氨基酸，也被证明机体通过额外补充，能够促进胎儿宫内的葡萄糖水平[21]。亮氨酸是机体的必需氨基酸，在蛋白质和能量代谢、缓解氧化应激以及机体免疫力等方面具有重要作用。此外，机体内的亮氨酸也能通过胰岛素依赖机制进一步增强葡萄糖摄取能力。Fowden 等[22]研究也表明，IUGR 仔猪中亮氨酸水平显著降低。缬氨酸作为哺乳动物体内的主要支链氨基酸之一，其通过氧化分解而产生能量的效率比非支链氨基酸高[23]。丙氨酸是葡萄糖代谢途径中的重要调节剂，也能够作为原料通过丙酮酸转化产生能量。本研究中IUGR组的缬氨酸和丙氨酸含量低于对照组，表明新生羔羊机体由于营养不良，过量分解氨基酸用于维持自身能量需求。作为酪胺、多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素等多种蛋白质合成和能量产生的重要基质，酪氨酸在胎儿发育中调节神经系统功能，同时也在应激中具有一定作用[24-25]。本研究中酪氨酸含量的降低，说明羔羊由于IUGR阻碍了神经系统的发育。
目前，3-甲基组氨酸已经被证明与丙酸血症等多种先天性代谢病相关，且其含量在临床中也被作为肌肉蛋白质分解速率的指标[26]。以往的研究中也证实了通过检测3-甲基组氨酸在羊水中的水平，可以作为人类IUGR的产前检测指标[27]。
3.3 糖和能量代谢分析
糖类物质是哺乳动物胎儿在宫内发育的重要营养元素。葡萄糖是胎儿在宫内维持细胞能量代谢的重要原料，对胎儿组织器官的生长发育具有重要作用[28]。胎儿宫内生长发育所需的葡萄糖主要是通过母体和胎儿两者中的葡萄糖含量梯度，完成母体-胎盘-胎儿的运输。胎儿在生长发育过程中通过胎盘摄取的外源性葡萄糖含量不足时，会通过内源性葡萄糖生成系统，分解自身储备的营养物质为糖原，以维持自身的葡萄糖含量[29]。乳酸是机体维持内环境稳态的信号分子，也是机体内能量平衡和组织含氧量的评价指标之一[30]。当机体内葡萄糖含量不足时，乳酸能够由乳酸脱氢酶转化为丙酮酸，之后通过糖异生途径进一步转化为葡萄糖，为机体提供能量。本研究结果说明，羔羊由于营养不良，已经出现体内糖代谢紊乱，且由于葡萄糖含量降低，大量的乳酸也被用于合成葡萄糖。
3.4 氧化应激代谢分析
哺乳动物因营养或其他外界因素导致体内氧化和抗氧化系统失衡，机体会产生大量活性氧自由基，而过量的自由基蓄积导致机体无法清除时，会造成氧化应激。哺乳动物胎儿宫内生长发育不良不仅会引起糖类、脂类、氨基酸类等多种物质代谢的变化，也会引起胎儿的抗氧化能力下降[31]。张崇志等[32]报道，过IUGR会引发绵羊胎儿的氧化应激，影响其肝脏等组织器官的生长发育。本研究中，IUGR 羔羊血浆中N-乙酰半胱氨酸含量均显著低于NBW 羔羊，而IUGR 组甜菜碱含量显著高于NBW 组。N-乙酰半胱氨酸是L-半胱氨酸的衍生物，也是机体内形成抗氧化剂谷胱甘肽的前体，对细胞的抗氧化和抗炎症均具有重要作用[33]。IUGR羔羊的N-乙酰半胱氨酸降低，说明机体由于IUGR，发生氧化应激增多，而N-乙酰半胱氨酸作为“抗氧化剂”被过多的消耗。以往研究也显示，N-乙酰半胱氨酸的处理能够改善由脂多糖诱导的小鼠胎儿IUGR，并提高胎儿存活率[34]。甜菜碱，又称为N,N,N-三甲基甘氨酸，是机体内的甲基化供体，而胎儿的甲基化进程等表观遗传修饰能够指导重构胚胎的正常发育[35]。本研究中，IUGR 组羔羊甜菜碱的血浆浓度显著升高，可能影响了胎儿在宫内的生长发育及胎盘分化。
基于代谢组学技术的1H-NMR 检测方法能够全面反映健康羔羊与IUGR 羔羊的血液代谢轮廓。本研究通过检测与数据的生物信息学分析结合，鉴别了IUGR 羔羊血液一些潜在的小分子代谢轮廓，为复杂的IUGR 发病机理与诊疗提供了新的方向。试验结果显示，IUGR羔羊的血液代谢主要涉及氨基酸、糖类、脂类物质等代谢通路。该结果有助于更好地理解IUGR 发生机理，并为进一步寻找IUGR诊断标示物提供了理论基础。
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