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王方国，陈胜利，颜新敏，郝华芳，兰仕梅，李章程，马丽娜，储岳峰*,曹随忠
(1.中国农业科学院 兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃 兰州 730046；
2.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130)
牦牛(Bosgrunniens)因对青藏高原地带严寒、缺氧、缺草等恶劣条件具有良好的适应能力而成为提高牧民经济收入和生活水平的重要养殖畜种[1]。青藏高原牧区海拔高，氧气含量少，气候恶劣，极易导致牦牛患病。其中农牧民长期粗放地经营管理和牦牛的近亲繁殖，导致畜群结构不合理、品种退化等严重后果使牦牛呼吸道疾病中以牛支原体(Mycoplasmabovis，M.bovis)引起的呼吸道疾病发病率逐年升高[2]。
牛支原体在微生物分类上属于支原体科支原体属，该病原具有体型微小、基因组小等支原体显著特点[3]。除能引起牛发生肺炎、乳腺炎以外，还可导致关节炎、角膜结膜炎、中耳炎、生殖道炎、流产与不孕等多种疾病[4-5]。在国外首次报道分离牛支原体后[6]，我国于1983年首次在牛奶中分离到该病原体，随后陆续有从其他部位和地区成功分离牛支原体的报道[7]。青海省为牦牛养殖大省，截至2019年青海省现存栏牦牛480.97万头，占世界牦牛的32%，居全国首位[8]。而在最新关于牦牛感染支原体疾病的报道中发现，我国青藏高原的牦牛群中支原体的阳性率高达48.70%，且呈现出逐年上升的趋势，给我国养牛业造成了巨大的经济损失[9-11]。目前关于青海地区牦牛牛支原体病原学调查和系统性分析尚未见报道。因此，本研究以青海地区牦牛为研究对象开展调查，检测该地区牦牛牛支原体流行情况，并系统性分析病原感染的相关性因素，为青海地区牦牛牛支原体病的防控提供理论依据。
1.1 临床样本2018年11月和2019年6月在青海地区(西宁市、海南州、海西州、海北州)共采集到牦牛鼻拭子636份，并对场地、采样时间、年龄、性别以及饲养方式等样本数据进行了详细记录。鼻拭子样品采用一次性无菌棉签深入鼻腔10 cm深度采集，置于灭菌试管，于冰盒保存送至实验室进行病原检测。样品信息见表1，2。
表1 样品信息
1.2 主要试剂和仪器2×Goldstar TaqMan Mixture购自康为世纪有限公司；
DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit,DP301-02)购自北京天根科技有限公司；
质粒提取试剂盒(OMEGA Endo-free Plasmid Mini Kit Ⅱ D6950-01)购自广州飞扬生物工程有限公司；
BIORAD荧光定量PCR仪CFX96购自BIO-RAD(美国)公司。
1.3 引物及探针参照SACHSE等[12]设计的牛支原体病原检测引物和探针(表3)，由西安擎科生物有限公司合成。
表3 检测相关的引物和探针
1.4 阳性标准质粒的构建根据GenBank已公布的牛支原体全基因组序列，利用引物oppD-F/oppD-R确定阳性标准靶基因序列：5′-TCAAGGAACCCCACCAGATATGGCAAACTTACCTATCGG-TGACCCTTTTGCACCTAGAAATGACTTTGC-CT-3′。该基因片段被送至武汉金开瑞生物工程有限公司合成并连接至pUC57克隆载体，获得阳性菌液和质粒。使用分光光度计测定质粒浓度并计算靶基因拷贝数，随后将其稀释为1×101～1×108拷贝/μL，-20℃保存备用。
表2 样品分组信息
1.5 DNA的提取将采集的牦牛鼻拭子放入2 mL EP管并做好标记，加入1 mL pH 7.2 的0.01 mol/L PBS缓冲液，在振荡器上振荡30 s，室温放置浸泡1 h，挤压干净后丢弃棉拭子，浸泡液12 000 r/min 离心10 min，弃上清，沉淀用DNA提取试剂盒按照明书提取病原基因组DNA，并用分光光度计测定其浓度，-20℃保存备用。
1.6 牛支原体qPCR方法的重建用Elution Buffer缓冲液将提取的质粒10×倍比系列稀释，使浓度分别为1×101～1×107拷贝/μL作为模板，反应体系：2×GoldStar TaqMan Mixture 10.0 μL，RNase Free dH2O 7.5 μL，上、下游引物(10 mol/L)各0.5 μL，探针P(10 mol/L)0.5 μL，DNA模板1.0 μL，合计20.0 μL。qPCR扩增反应程序：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火60 s，40个循环。扩增完成后，以质粒拷贝数的对数值Log(X)为X轴，以Ct值为Y轴，建立标准曲线。
1.7 牛支原体qPCR方法的特异性与敏感性检测以牛支原体07801株基因组DNA为阳性对照、Nuclease-free water为阴性对照，用上述qPCR方法对实验室保存的绵羊肺炎支原体、无乳支原体、牛生殖道支原体、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种、山羊支原体山羊亚种、牛鼻支原体、殊异支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、牛沙门菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌基因组DNA进行扩增、检测。
用Elution Buffer将牛支原体的标准质粒进行梯度稀释(1×101～1×108拷贝/μL)为模板，进行扩增。
1.8 临床样品检测以提取并保存好的636份牦牛鼻拭子的DNA为模板，标准质粒为阳性对照，RNase Free dH2O为阴性对照。按照上述反应体系和程序进行qPCR。
试验有效性判定：阳性对照标准曲线生成，阴性对照Ct值为40，阳性判定：样本拷贝数≥标准品102拷贝数，阴性判定：样本拷贝数<标准品102拷贝数。
1.9 数据分析所有数据采用统计软件SPSS 18.0进行分析，采用卡方分析不同统计结果，探究每个因素内部是否存在差异，以P<0.05作为差异显著性判断标准。
2.1 牛支原体qPCR重建与验证TaqMan探针实时荧光定量PCR扩增结束后，不同浓度梯度重组质粒的扩增曲线见图1，结果显示，扩增效率E为98.3%，相关系数(R2)为0.990，线性回归方程为：Y=-3.363 Log(X)+43.105。由此可见，质粒浓度(拷贝数)与Ct值之间存在良好的线性关系。特异性结果显示，牛支原体DNACt值小于22，阴性对照无扩增荧光信号，其他病原基因组DNA的Ct值均大于35，表明检测方法特异性良好(图2)。敏感性结果如图3所示，牛支原体敏感性为1×101个拷贝/μL。
图1 梯度稀释牛支原体质粒的qPCR扩增曲线和标准曲线
图2 特异性检测结果
1～8.1×108～1×101拷贝/μL 质粒标准品；
9.阴性对照
2.2 不同采样点牛支原体核酸检测阳性率由表4和图4可知，青海地区牛支原体整体阳性率为21.86%，其中，海北州祁连县采样点C、海北州祁连县采样点D和海南州贵南县采样点F1阳性率较高，海南州贵南县采样点F2和海西州乌兰县采样点A阳性率较低。
表4 不同采样点检测结果
图4 青海地区不同采样点检测结果
2.3 不同时间牛支原体核酸检测阳性率由表5可知，2019年样品阳性率明显高于2018年样品，差异显著(P<0.05)。
表5 不同时间检测结果
2.4 不同性别牛支原体核酸检测阳性率由表6可知，雌性牦牛阳性率明显高于雄性牦牛和未知性别牦牛，差异显著(P<0.05)。
表6 不同性别检测结果
2.5 不同年龄牛支原体核酸检测阳性率由表7可知，0～2岁牦牛牛支原体阳性检出率高于3～6岁和7～12岁年龄段的牦牛。
表7 不同年龄检测结果
2.6 不同饲养模式牛支原体核酸检测阳性率由表8可知，在放牧养殖模式下，牛支原体阳性率明显高于放牧+圈养、集约化养殖模式，差异极显著(P<0.01)。
本研究首次系统地调查了青海地区牦牛牛支原体感染的流行病学情况，李坤等[13-14]和王冬经等[15]采用ELISA对我国西藏和四川等地牦牛牛支原体抗体检测，抗体阳性率为40%～50%。魏廷虎等[16]在青海玉树州对382份牦牛血清进行支牛原体抗体检测，共检测出97份阳性，阳性率为25.39%(97/382)，牦牛牛支原体血清检测结果发现高抗体阳性率。王冬经等[17]在西藏通过病原分离培养，从145份患有呼吸道症状的牦牛鼻拭子中分离出10株牛支原体，青海目前还没有做牛支原体临床发病流行病学研究，说明青海可能有牛支原体在牦牛群流行，本次病原学检测结果表明牛支原体平均阳性率为21.86%，其中海北州祁连县采样点C(44.00%)、海北州祁连县采样点D(34.00%)以及海南州贵南县采样点F1(33.33%)牛支原体阳性检出率较高，提示牛支原体在青海不同地区存在不同程度的流行。本研究是第一次大规模从病原学检测(核酸检测)角度证实本病原流行于青海牦牛，具有重要的流行病学意义。
本研究发现，2018年青海地区牦牛牛支原体阳性率为18.02%(62/344)，而2019年阳性率为26.37%(77/292)，提示牦牛支原体感染在近年来存在逐年上升的趋势。李坤等[13-14]在2012年和2013年对西藏和四川地区牦牛血清进行牛支原体抗体检测，发现抗体阳性率也存在上升的情况。以上研究表明，牛支原体感染在牛群中有升高的趋势，需要警惕和及时应对。
有研究发现四川、甘肃、西藏、青海牦牛牛支原体感染情况中呈现出明显的性别、年龄差异，雌性感染率较雄性高，年幼牦牛高于年长牦牛[18]。本研究相关因素分析显示性别、年龄以及饲养条件与牛支原阳性率存在相关性，雌性牦牛阳性率(27.84%)高于雄性牦牛(18.41%)。0～2岁牦牛(22.26%)相比于3～6岁(19.50%)与6～12岁(18.03%)的牦牛对牛支原体更加易感。幼龄牦牛由于免疫系统发育不全和免疫低下，与成年动物相比更易感牛支原体。不同饲养模式下，牦牛牛支原体检出率存在显著差异，放牧养殖模式下牛支原体阳性率最高，集约化养殖模式次之，而放牧+圈养最低。造成以上检查结果的原因可能是由于放牧养殖模式是牧民以家庭为单位进行牦牛养殖，饲养水平参差不齐，同时依赖天然牧场，管理粗放以及饲草单一且不稳定，因此不利于牦牛的生长和健康；
而放牧+圈养提供充足的草料与科学合理的饲养管理，从而增强了牦牛对病原微生物的抵抗力[19-20]，感染率最低，而集约化养殖模式下饲养密度过高，容易拥挤，增加了呼吸道病原感染的风险。本研究表明牛支原体在青海地区牦牛群中存在不同程度的流行，部分地区和养殖场高达40%以上，应引起重视。相关部门应加强宣传,使得养殖户充分了解和认识牛支原体病对畜牧业的危害，加强饲养管理和疫病控制。同时本试验提供了风险因素与病原感染之间的关系，这将有助于在该地区对这些病原制定适当的控制策略。
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